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673643401

铁虫 (小有名气)

[求助] ELISA阴性对照显色问题已有2人参与

原理:检测蛋白与结合蛋白能够相互作用结合,结合蛋白带C-FC标签,最后加入FC抗体(带HRP),TMB显色。
检测蛋白:A1-A8,B1-B8(复孔)
阴性对照:A9-A10,B9-B10(复孔)
说明:1-8中结合蛋白浓度依次减半,阴性对照中所加的结合蛋白浓度与A1相同。阴性对照用BSA包板,其他的操作与检测孔一样。
问题:为什么我的阴性对照颜色这么深?我自己感觉我的封闭和洗脱没有问题,BSA没有污染,但就是找不到原因,折腾了一个月了,哪位大神指点一下,感激不尽!!!小弟的金币数很少,全部拿出。感谢!
具体步骤:
1.        包被:检测蛋白按1ul/ml的浓度包板,条件4℃过夜。
2.        洗涤:PBS清洗3次,每次2min。
3.        封闭:用3% BSA ,室温1h。
4.        洗涤:PBS清洗3次,每次2min。
5.        结合:加入结合蛋白,37℃ 1h。
6.        洗涤:PBST清洗3次,每次2min
7.        杂交:用1%的BSA配制anti-FC抗体(比例1;10000),37℃ 1h。
8.        洗涤:PBST清洗3次,每次2min。
9.        反应:TMB溶液避光37℃15min左右。
10.        终止:1M HCL终止。

ELISA阴性对照显色问题
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huiting410

金虫 (著名写手)

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huiting410

金虫 (著名写手)

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感谢参与,应助指数 +1
673643401: 金币+2, 有帮助 2015-07-30 09:01:29

673643401

铁虫 (小有名气)

huiting410

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673643401: 金币+2, 有帮助 2015-07-31 09:15:18
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