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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » ELISA阴性对照显色问题
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673643401

铁虫 (小有名气)

[求助] ELISA阴性对照显色问题已有2人参与

原理：检测蛋白与结合蛋白能够相互作用结合，结合蛋白带C-FC标签，最后加入FC抗体（带HRP),TMB显色。
检测蛋白：A1-A8，B1-B8(复孔)
阴性对照：A9-A10，B9-B10(复孔)
说明：1-8中结合蛋白浓度依次减半，阴性对照中所加的结合蛋白浓度与A1相同。阴性对照用BSA包板，其他的操作与检测孔一样。
问题：为什么我的阴性对照颜色这么深？我自己感觉我的封闭和洗脱没有问题，BSA没有污染，但就是找不到原因，折腾了一个月了，哪位大神指点一下，感激不尽！！！小弟的金币数很少，全部拿出。感谢！
具体步骤：
1.        包被：检测蛋白按1ul/ml的浓度包板，条件4℃过夜。
2.        洗涤：PBS清洗3次，每次2min。
3.        封闭：用3% BSA ,室温1h。
4.        洗涤：PBS清洗3次，每次2min。
5.        结合：加入结合蛋白，37℃ 1h。
6.        洗涤：PBST清洗3次，每次2min
7.        杂交：用1%的BSA配制anti-FC抗体（比例1；10000），37℃ 1h。
8.        洗涤：PBST清洗3次，每次2min。
9.        反应：TMB溶液避光37℃15min左右。
10.        终止：1M HCL终止。

ELISA阴性对照显色问题
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1楼2015-07-28 16:27:05
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huiting410

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
673643401: 金币+2, ★有帮助 2015-07-30 09:01:29
BSA包被浓度是多少，怀疑太大了，你做个BSA包被时的浓度梯度，估计也能看出来颜色变化，而且洗的时间和次数有点短，我一般洗5次，前两次涮，后三次5min/time。
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2楼2015-07-30 04:43:53
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673643401

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huiting410 at 2015-07-30 04:43:53
BSA包被浓度是多少，怀疑太大了，你做个BSA包被时的浓度梯度，估计也能看出来颜色变化，而且洗的时间和次数有点短，我一般洗5次，前两次涮，后三次5min/time。

BSA包被浓度跟检测蛋白包被浓度一样，1ug/ml。我感觉这个因素不会影响，因为封闭的时候还用3%的BSA。
洗的时间我看网上也差不多3次 每次2min
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3楼2015-07-30 09:00:59
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huiting410

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
673643401: 金币+2, ★有帮助 2015-07-31 09:15:18
ELISA是分子之间相互作用，要看摩尔浓度，BSA和检测蛋白的分子量一定不一样，往往是BSA比较大，所以你用一样质量浓度做对照，实际摩尔浓度BSA要大很多，那他结合的非特异就会更多了
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4楼2015-07-31 01:40:30
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huiting410

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

补充，不知道你待测蛋白的分子量，BSA是66kd，不一定他会比你待测蛋白要大，你试一下摩尔浓度。至于方法你可以看一下nature protocol
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5楼2015-07-31 01:46:14
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673643401

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by huiting410 at 2015-07-31 01:46:14
补充，不知道你待测蛋白的分子量，BSA是66kd，不一定他会比你待测蛋白要大，你试一下摩尔浓度。至于方法你可以看一下nature protocol

1.理论上BSA是不会与我的二抗有反应的（所以用BSA来封闭），无论BSA的包板浓度是多少。就算按照摩尔浓度进行包板，之后的封闭用的BSA浓度更高，按照你的说法，那么非特异性结合就更多了。
2.顺便问一下elisa通常从那个摩尔浓度比进行稀释？
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6楼2015-07-31 09:15:03
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天剑

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
673643401: 金币+2 2015-07-31 12:48:05
先做个阴性实验，包被液中不加抗体。另外，感觉二抗反应时间有点长，可以减减时间。关于洗板的问题，多洗洗没坏处，我一般洗4次，至于洗板时间，没关心过，一般是2min左右，我的是机洗的，呵呵！！
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7楼2015-07-31 11:27:25
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673643401

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 天剑 at 2015-07-31 11:27:25
先做个阴性实验，包被液中不加抗体。另外，感觉二抗反应时间有点长，可以减减时间。关于洗板的问题，多洗洗没坏处，我一般洗4次，至于洗板时间，没关心过，一般是2min左右，我的是机洗的，呵呵！！

我的阴性对照包被液中没加抗体啊，加的是BSA。你的二抗反应多长时间？
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8楼2015-07-31 12:48:07
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天剑

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
673643401: 金币+1 2015-08-03 10:08:13
引用回帖:
8楼: Originally posted by 673643401 at 2015-07-31 12:48:07
我的阴性对照包被液中没加抗体啊，加的是BSA。你的二抗反应多长时间？...

包被不加抗体，加OVA封闭对照一下。先解决是否和BSA有交叉反应，再优化其他条件。
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9楼2015-08-03 09:18:29
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673643401

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 天剑 at 2015-08-03 09:18:29
包被不加抗体，加OVA封闭对照一下。先解决是否和BSA有交叉反应，再优化其他条件。...

谢谢了 ，我找到大概的原因了 我洗涤的原因
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10楼2015-08-03 10:08:14
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