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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » DNA凝胶电泳
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午夜魔兰

银虫 (正式写手)

[交流] DNA凝胶电泳

小弟用的是变性聚丙烯酰胺凝胶分离小于50个碱基的单链DNA，丙烯酰胺浓度20%， 100V电压，跑2-3h。发现DNA条带非常弱，基本看不出碱基，但是marker非常清晰（Low MW DNA Marker，25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 bp）。
请问：1，上样的DNA的浓度是多少？开始用60nM没有做条带来，后来用大浓度，大约300nM，还是没有条带，非常弱。
2，需要1500V预电泳吗，我没有进行这一步。
3，我做的实验条件有没有什么问题？
4，50个单链的DNA跑出的条带是对应于marker的25bp还是50bp？ 完全互补配对的双链DNA，每条链都是50个碱基，跑出的条带对应的是50bp还是100bp，谢谢！
DNA凝胶电泳
1.jpg
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小泓杨

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1楼 2015-07-25 11:03:19
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穆远life

木虫 (正式写手)
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午夜魔兰: 金币+1 2015-07-27 09:21:49
两个碱基一个BP，一个碱基对一BP.单连50碱基应该是25bp的marker，双链的50个碱基对，50bpmarker。做细致点，点marker都会弄到胶齿上，太粗糙了。
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8楼2015-07-26 10:12:19
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小泓杨

捐助贵宾 (初入文坛)

初出茅庐
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:15
午夜魔兰: 金币+3 2015-07-25 20:36:48
预电泳很容易忘。但是，有些事是真理的事就必须做。预电泳的目的就是除去介质中的杂质，如介质为PAG时，还可以清除凝胶中的丙烯酰胺。丙烯酰胺有剧毒，但是聚丙烯酰胺却没有毒。预电泳是设计在加样前的，估计时间为一小时。
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中国的-boy 是一个缺心眼子！
2楼2015-07-25 19:06:05
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匿名

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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3楼2015-07-25 20:02:09
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午夜魔兰

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小泓杨 at 2015-07-25 19:06:05
预电泳很容易忘。但是，有些事是真理的事就必须做。预电泳的目的就是除去介质中的杂质，如介质为PAG时，还可以清除凝胶中的丙烯酰胺。丙烯酰胺有剧毒，但是聚丙烯酰胺却没有毒。预电泳是设计在加样前的，估计时间为 ...

电压多少？
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4楼2015-07-25 20:36:59
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午夜魔兰

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小泓杨 at 2015-07-25 19:06:05
预电泳很容易忘。但是，有些事是真理的事就必须做。预电泳的目的就是除去介质中的杂质，如介质为PAG时，还可以清除凝胶中的丙烯酰胺。丙烯酰胺有剧毒，但是聚丙烯酰胺却没有毒。预电泳是设计在加样前的，估计时间为 ...

仅仅是因为没有预电压才出现上述现象吗？为什么marker没影响？
其他步骤有没有影响
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5楼2015-07-25 20:37:47
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lhs8625
祝福祝福祝福祝福祝福
6楼2015-07-25 20:52:01
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小泓杨

捐助贵宾 (初入文坛)

初出茅庐
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
午夜魔兰: 金币+2 2015-07-27 09:21:58
我原先做的时候也是批不出来。但是marker还在那里，它比较抗造，就是它最容易留下印记。电压一般范围就可以，你原先用什么电压，就用什么电压，稍微调调也可以，这个没有讲究。
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中国的-boy 是一个缺心眼子！
7楼2015-07-26 08:54:13
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lxzk

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 穆远life at 2015-07-26 10:12:19
两个碱基一个BP，一个碱基对一BP.单连50碱基应该是25bp的marker，双链的50个碱基对，50bpmarker。做细致点，点marker都会弄到胶齿上，太粗糙了。

你跑过单链DNA吗，尤其是短单链DNA,迁移率和EB染色效率都取决于序列，我手上的63nt引物刚好在50bp marker的位置，而50nt引物介于25bp与50bp之间，更接50bp。如果是随机序列会形成多条带或者smear。短单链DNA染色效率很低，一般要100ng才能看到清晰的带，同聚物几乎染不上。

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9楼2015-07-27 10:00:52
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lxzk

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
尿素浓度多少？上样前最好做一下变性，另外上样量不是看浓度，是看总量，我一般上100ng，更多也可以，染色效率也跟序列有关系。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2015-07-27 10:06:09
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