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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » DNA提取出问题
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z631535213

木虫 (正式写手)

[求助] DNA提取出问题 已有2人参与

最近做人的DNA提取，取得是脱落细胞。分别配制了1%的NP-40、0.1%的NP-40、1%的Triton-X100、0.1%的Triton-X100以及0.1%的SDS，缓冲体系是50mM的Tris-HC溶液，pH=8.0。另设不加任何去垢剂的空白组，每组两个样，共12个样。
12组样均100℃加热10min，高速离心后用TE溶液稀释后用紫外分光光度计扫，发现都没提出DNA。
后来重新做了12个样，进行细胞制片显微镜下观察，没有看到细胞及细胞核，分析细胞及细胞核应该都已经裂解。
这样看的话应该是提取或是其他出问题了。


配制溶液的时候我用的去离子水或是双蒸水这个会影响实验吗？
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1楼 2015-07-14 08:33:40
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蓝色未央

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

会不会是裂解温度太高了，全被你降解了啊，按照你说的，提取脱落细胞，需要用100度的温度去裂解吗？一般口腔拭子提取和培养细胞提取DNA，56度或者65度的裂解温度就可以了吧。
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2楼2015-07-29 14:47:41
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 蓝色未央 at 2015-07-29 14:47:41
会不会是裂解温度太高了，全被你降解了啊，按照你说的，提取脱落细胞，需要用100度的温度去裂解吗？一般口腔拭子提取和培养细胞提取DNA，56度或者65度的裂解温度就可以了吧。

裂解用的100℃的金属浴，应该不是温度太高导致降解了。毕竟PCR也用到了高温，以前做实验是买的市面上的裂解液。有些贵，用的多了就考虑自己配制了。
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3楼2015-07-30 15:33:47
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果小胖子

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

第一：样品的采集是不是有一定的问题，用显微镜观察。
第二：是不是提取过程中DNA降解了：
        1）是否添加了足够的DNA酶抑制剂。
        2）裂解是否充分
        3）试剂是否存在过期的现象，以及裂解液是不是配制的不好
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4楼2015-08-10 13:01:11
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z631535213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 果小胖子 at 2015-08-10 13:01:11
第一：样品的采集是不是有一定的问题，用显微镜观察。
第二：是不是提取过程中DNA降解了：
        1）是否添加了足够的DNA酶抑制剂。
        2）裂解是否充分
        3）试剂是否存在过期的现象，以及裂解液 ...

样品应该没问题，Dnase的话有加入一定量的EDTA，现在就是不知道哪出问题，后面没法进行
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5楼2015-08-10 14:22:31
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