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俊松ing

木虫 (知名作家)

[求助] 各位虫友,我最近在克隆某基因的CDS区,但是它有3.5kb左右,总是P不出来 已有5人参与

各位虫友,我最近在克隆某基因的CDS区,但是它有3.5kb左右,总是P不出来,换了各种模板都不行。我该怎么办?有没有推荐的RT试剂盒或者什么方法啊?求教!
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thaw

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-14 11:27:18
如果还不行,建议分段扩增,然后再用融合PCR连接,或者使用同源从组试剂盒,详情自行百度
9楼2015-07-12 11:31:12
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普通回帖

俊松ing

木虫 (知名作家)

自己先顶一下!大家来帮忙啊!
如果你有梦想、全世界都会帮你实现
2楼2015-07-08 10:34:36
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nonglong1

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-08 18:47:55
首先你要保证提的RNA和反转的CDNA质量好,无降解。如果能知道这个基因在哪个组织或是条件下表达高就用那个样品的cDNA最好了。然后买一个扩长片段的PCR酶,试剂代理商肯定有卖的。
祝好运,求金币。
植物学
3楼2015-07-08 16:40:17
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-08 18:48:08
什么材料?RNA好不好,引物设计过关了没?这些都是关键

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2015-07-08 18:06:13
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俊松ing

木虫 (知名作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by nonglong1 at 2015-07-08 16:40:17
首先你要保证提的RNA和反转的CDNA质量好,无降解。如果能知道这个基因在哪个组织或是条件下表达高就用那个样品的cDNA最好了。然后买一个扩长片段的PCR酶,试剂代理商肯定有卖的。
祝好运,求金币。

不知道怎么查基因在组织中的表达量,现在只能在实验室已有的细胞系里面试,怎么办?要不要westernblot检测一下不同细胞系这一基因的本底表达量?
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5楼2015-07-08 18:52:24
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俊松ing

木虫 (知名作家)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-07-08 18:06:13
什么材料?RNA好不好,引物设计过关了没?这些都是关键

材料是肿瘤细胞,RNA质量不知道好不好啊,实验室条件比较简陋,P个基因全长或者长的CDS就是要命啊,师兄说引物设计没问题~
如果你有梦想、全世界都会帮你实现
6楼2015-07-08 18:54:50
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wsad5213

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-09 21:22:50
你要想克隆基因,最关键的是提取RNA的质量,以及反转录的质量!我们克隆基因都是分为3个步骤,中间片段的扩增,3`序列扩增,以及5`序列的扩增!如果你中间片段都没有扩增出来那么问题只有两个,第一你取样的部位可能该基因不表达,第二你引物有问题!扩增出中间片段后用试剂盒扩增两端就可以了!总之一定要保证RNA质量
7楼2015-07-09 16:33:59
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thaw

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-14 11:27:05
原因1、目的基因是诱导表达的,样品中表达量低
2、反转效果不好,不能把长基因反转完全
3、PCR酶不适合扩增长片段
建议
1,重新提RNA诱导后的材料
2,换反转录酶建议用英骏的
3,换PCR酶,建议用KAPA
8楼2015-07-12 11:30:01
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lws9930

至尊木虫 (著名写手)

试一试overlap PCR吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

10楼2015-07-12 12:06:16
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