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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 各位虫友，我最近在克隆某基因的CDS区，但是它有3.5kb左右，总是P不出来
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俊松ing

木虫 (知名作家)

[求助] 各位虫友，我最近在克隆某基因的CDS区，但是它有3.5kb左右，总是P不出来 已有5人参与

各位虫友，我最近在克隆某基因的CDS区，但是它有3.5kb左右，总是P不出来，换了各种模板都不行。我该怎么办？有没有推荐的RT试剂盒或者什么方法啊？求教！
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如果你有梦想、全世界都会帮你实现
1楼 2015-07-08 10:33:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

thaw

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-14 11:27:18
如果还不行，建议分段扩增，然后再用融合PCR连接，或者使用同源从组试剂盒，详情自行百度
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9楼2015-07-12 11:31:12
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普通回帖

俊松ing

木虫 (知名作家)
自己先顶一下！大家来帮忙啊！
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如果你有梦想、全世界都会帮你实现
2楼2015-07-08 10:34:36
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nonglong1

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-08 18:47:55
首先你要保证提的RNA和反转的CDNA质量好，无降解。如果能知道这个基因在哪个组织或是条件下表达高就用那个样品的cDNA最好了。然后买一个扩长片段的PCR酶，试剂代理商肯定有卖的。
祝好运，求金币。
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植物学
3楼2015-07-08 16:40:17
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-08 18:48:08
什么材料？RNA好不好，引物设计过关了没？这些都是关键

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2015-07-08 18:06:13
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俊松ing

木虫 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by nonglong1 at 2015-07-08 16:40:17
首先你要保证提的RNA和反转的CDNA质量好，无降解。如果能知道这个基因在哪个组织或是条件下表达高就用那个样品的cDNA最好了。然后买一个扩长片段的PCR酶，试剂代理商肯定有卖的。
祝好运，求金币。

不知道怎么查基因在组织中的表达量，现在只能在实验室已有的细胞系里面试，怎么办？要不要westernblot检测一下不同细胞系这一基因的本底表达量？
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如果你有梦想、全世界都会帮你实现
5楼2015-07-08 18:52:24
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俊松ing

木虫 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-07-08 18:06:13
什么材料？RNA好不好，引物设计过关了没？这些都是关键

材料是肿瘤细胞，RNA质量不知道好不好啊，实验室条件比较简陋，P个基因全长或者长的CDS就是要命啊，师兄说引物设计没问题~
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如果你有梦想、全世界都会帮你实现
6楼2015-07-08 18:54:50
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wsad5213

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-09 21:22:50
你要想克隆基因，最关键的是提取RNA的质量，以及反转录的质量！我们克隆基因都是分为3个步骤，中间片段的扩增，3`序列扩增，以及5`序列的扩增！如果你中间片段都没有扩增出来那么问题只有两个，第一你取样的部位可能该基因不表达，第二你引物有问题！扩增出中间片段后用试剂盒扩增两端就可以了！总之一定要保证RNA质量
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7楼2015-07-09 16:33:59
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thaw

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
俊松ing: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-07-14 11:27:05
原因1、目的基因是诱导表达的，样品中表达量低
2、反转效果不好，不能把长基因反转完全
3、PCR酶不适合扩增长片段
建议
1，重新提RNA诱导后的材料
2，换反转录酶建议用英骏的
3，换PCR酶，建议用KAPA
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8楼2015-07-12 11:30:01
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lws9930

至尊木虫 (职业作家)
试一试overlap PCR吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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俊松ing
10楼2015-07-12 12:06:16
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