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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 凋亡DNA Ladder 检测
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tianlanchong

新虫 (初入文坛)

[求助] 凋亡DNA Ladder 检测 已有1人参与

新虫一只，第一次在小木虫提问我这周开始做DNA ladder实验，今天刚得到这样一张图，看不太懂，请各位有经验的同学帮忙分析一下结果，谢谢！我想知道我的DNA是不是降解了，能否从这张图看出凋亡的情况？
我的操作步骤是这样的：
(1) 取100~300mg冻存的动物组织，用小剪刀尽量剪碎，转入匀浆器，加入1ml裂解液，电动匀浆。室温放置5分钟。
(2) 裂解细胞：加1ml细胞裂解液，裂解液在使用前加入RNase（20mg/ml）使其终浓度为20μg/mg，之后37℃孵育37分钟；充分混匀再加蛋白酶K（20mg/ml）100μl，置65℃水浴消化2小时或过夜；
(3) 蛋白处理：加750μl 8mol/L的醋酸钾，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10分钟后，将上清移至一新的Eppendorf管中；
(4) 沉淀DNA：加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12000r/min离心10分钟，去上清；
(5) 洗涤DNA：加1ml70%乙醇，混匀，10000r/min 离心5min，去上清；
(6) 溶解DNA：根据 DNA 沉淀的大小，加一定量的蒸馏水或TE，37℃溶解；
(7) 测定DNA浓度；
(8) 2%琼脂糖凝胶电泳80V 2小时；
衷心感谢给我回复的大虾们！

裂解液的配方：
10mM TRIS-HCL, 0.1M EDTA， 0.8%（m/v）SDS

凋亡DNA Ladder 检测
2015-06-03 dna ladder 1.jpg
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1楼 2015-06-04 10:51:09
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tianlanchong: 金币+2, ★有帮助 2015-06-05 09:02:43
我从7、8、9三个lane看到了肯定是有DNA弥散式降解，但是在200kb的带不亮，好像还比较暗，相对而言，所以仅凭此图，我个人为：不能证明细胞发生了凋亡。
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2楼2015-06-04 11:18:09
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tianlanchong

新虫 (初入文坛)
DNA ladder 的原理：
“在细胞凋亡时，内源性Mg、Ca依赖性核酸内切酶被激活，切割细胞DNA，使其成核小体间DNA链的断裂、大分子DNA链的断裂及DNA单链的断裂。其中以核小体之间DNA断裂时最多见的一种断裂方式，断裂形成的DNA长度为核小体DNA长度的整数倍，即180～200bp的整数倍。通过提取凋亡细胞的基因组DNA在1.5~2%(一般是这个浓度^_^)琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察可见到特征性的“梯状”（ladder）DNA条带。此称DNA LADDER实验。而坏死的细胞DNA则成模糊的弥散条带。”摘自细胞世界论坛.
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3楼2015-06-04 22:07:36
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tianlanchong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-04 11:18:09
我从7、8、9三个lane看到了肯定是有DNA弥散式降解，但是在200kb的带不亮，好像还比较暗，相对而言，所以仅凭此图，我个人为：不能证明细胞发生了凋亡。

谢谢您的回复，我有一个疑问挺困扰的，希望能和您讨论一下，如何区分在提取过程中DNA降解和由于细胞坏死的引起的弥散式降解，这两者有何区别？
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4楼2015-06-04 22:13:45
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tianlanchong

新虫 (初入文坛)
我有几个问题：
1、由于这个实验用的是冻存的动物肝胰腺组织的匀浆液，而不是培养的细胞，也不是用液氮研磨制成的样，不知是否会影响最终的结果？
2、裂解液我选的是分子指南上的用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子量DNA作用的裂解液，蛋白处理及之后的实验操作都是从网上下载的，应用于细胞DNA ladder的，不知是否可行？
3、由于实验操作导致的DNA降解和细胞坏死导致的弥散式降解在电泳图上是否有区别，如何进行区分？
请做过的各位大神帮我解答分析一下，不胜感激！
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5楼2015-06-04 22:38:01
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
tianlanchong: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-06-05 09:02:07
引用回帖:
4楼: Originally posted by tianlanchong at 2015-06-04 22:13:45
谢谢您的回复，我有一个疑问挺困扰的，希望能和您讨论一下，如何区分在提取过程中DNA降解和由于细胞坏死的引起的弥散式降解，这两者有何区别？...

在细胞凋亡时的200bp及其整数倍的DNA电泳带应该非常亮，但是肯定也有一些弥散的带，但是弥散的带的亮度因该不会比200bp及其整数倍的DNA电泳带更亮，至少在样品细胞的凋亡持续发生时。而坏死的情况下，DNA带肯定是弥散的，电泳如同地毯。
不过要是有条件的话，建议先用流式细胞仪把凋亡的细胞给筛选出来，在做DNA ladder。
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6楼2015-06-05 08:33:23
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by tianlanchong at 2015-06-04 22:38:01
我有几个问题：
1、由于这个实验用的是冻存的动物肝胰腺组织的匀浆液，而不是培养的细胞，也不是用液氮研磨制成的样，不知是否会影响最终的结果？
2、裂解液我选的是分子指南上的用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中 ...

我不知道你的具体的操作流程，如果操作流程没有错误，因该是能够用于你的样品细胞。
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7楼2015-06-05 08:34:35
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tianlanchong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-05 08:34:35
我不知道你的具体的操作流程，如果操作流程没有错误，因该是能够用于你的样品细胞。...

实验室条件有限，很多实验都不能用流式检测，嘻嘻，我再试一下其他样品，这是第一次做的，谢谢哦！
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8楼2015-06-05 09:10:27
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