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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 前处理 » 大家好，我想请教一下反相HPLC分析蛋白样品时，前处理应该怎能做
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xuelvsnow

新虫 (小有名气)

[求助] 大家好，我想请教一下反相HPLC分析蛋白样品时，前处理应该怎能做 已有5人参与

我之前用过C18，C8 流动相是 A：水 0.1%三氟乙酸 B：乙腈或甲醇 0.085%三氟乙酸
上样是20ul，
今天发现 我的样品在B液中析出大量沉淀  这样会不会对我的柱子有影响啊，因为我发现上样次数多了，检测出的峰偏低 偏少了，甚至没有什么峰了。
我的样品前处理是：将1g样品 溶于10ml PH7.0的50mMPBS中 超速离心取上清。  
我想知道，如果我的样品在有机相中沉淀，是不是前处理的问题，如有是的话应该怎么办呢；还是需要调节有机相啊？
图片中分别是 水；乙腈；甲醇；乙醇；异丙醇；(纯的)  100-200ul样品 +1mL溶剂 离心后的效果
非常感谢大家的帮助!

大家好，我想请教一下反相HPLC分析蛋白样品时，前处理应该怎能做
IMG_0589.JPG
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1楼 2015-05-14 22:30:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

archbishop

禁虫 (职业作家)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuelvsnow: 金币+5, ★★★很有帮助, O(∩_∩)O谢谢你的文献，给了我些思路。 2015-05-16 14:45:41
TFA、甲醇、乙腈随便一个都能使蛋白沉淀。我建议你查查文献。这里给你找了一篇供参考。
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    • 2015-05-15 11:41:49, 62.59 K
雲幕低垂映桂子，江月留白問柳心。
4楼2015-05-15 11:41:50
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青雅

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuelvsnow: 金币+3, ★有帮助, O(∩_∩)O谢谢，我的目标物是蛋白，不能除去。 2015-05-16 14:46:37
一般来说，甲醇和乙腈有沉淀蛋白的作用，蛋白析出当然会对柱子不好，会堵，而且不好修复。建议改进样品处理方法，可以直接用甲醇沉淀除尽蛋白再离心进样

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-05-14 23:02:47
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xuziling

金虫 (正式写手)
我们以前测的药物，所以要先沉淀蛋白，但你测的蛋白，如果用甲醇、乙腈沉淀了还怎么测？
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开心每一天
5楼2015-05-15 11:55:41
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organicsuper

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuelvsnow: 金币+4, ★★★很有帮助, O(∩_∩)O谢谢，我是第一次做蛋白的高效液相，浓度因素真的是很重要。 2015-05-16 14:42:33
6mg/mL....................浓度太高了吧,我这边做1mg/mL,都还要稀释才行!
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9楼2015-05-16 08:11:25
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普通回帖

xuelvsnow

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 青雅 at 2015-05-14 23:02:47
一般来说，甲醇和乙腈有沉淀蛋白的作用，蛋白析出当然会对柱子不好，会堵，而且不好修复。建议改进样品处理方法，可以直接用甲醇沉淀除尽蛋白再离心进样

那还有蛋白样品吗  我是测蛋白的
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3楼2015-05-15 08:51:48
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mao877516786

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
archbishop: 化学化工区禁止留下联系方式。 2015-05-15 13:12:09
xuelvsnow: 金币+4, ★★★很有帮助, O(∩_∩)O谢谢 我的柱压没有怎么变好像 2015-05-16 14:44:38
纯的有机相出现沉淀应该算是正常现象吧，而且在洗脱浓度是也不是纯有机相相呀，你又不是用纯有机相洗脱，至于为什么你的峰会越来越矮，不好说，有没有可能存在降解。。。。。还有你的柱压升高了么，样品在色谱柱析出，柱压应该会有反应才是。。。
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6楼2015-05-15 12:40:42
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xuelvsnow

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mao877516786 at 2015-05-15 12:40:42
纯的有机相出现沉淀应该算是正常现象吧，而且在洗脱浓度是也不是纯有机相相呀，你又不是用纯有机相洗脱，至于为什么你的峰会越来越矮，不好说，有没有可能存在降解。。。。。还有你的柱压升高了么，样品在色谱柱析出 ...

刚才查了查之前做的图，发现柱压没有怎么升高，我今天又做了几个实验 30-100%的乙腈都能使我的样品有沉淀，而且不可再用水溶解，甲醇的也有沉淀，用水能溶解。
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7楼2015-05-15 19:09:15
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xuelvsnow

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuziling at 2015-05-15 11:55:41
我们以前测的药物，所以要先沉淀蛋白，但你测的蛋白，如果用甲醇、乙腈沉淀了还怎么测？

我也觉得我的样品蛋白量（~6mg/ml），测出来的峰高有点低。
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8楼2015-05-15 19:10:50
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songbingna

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuelvsnow: 金币+3, ★有帮助, 谢谢O(∩_∩)O~还是先找找这个方法的问题，然后再换。 2015-05-16 14:40:30
蛋白在有机相中是会沉淀，不行，你就换方法咯。。

[ 发自小木虫客户端 ]
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comeonbaby
10楼2015-05-16 08:52:23
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