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我都哭了~~~~~~~~~~~·5端RACE胶图，求大神指点~~~~~~~~~~~~~~ 已有2人参与
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求各位大神指点，这是我简易RACE第一轮PCR的胶图。 体系： 5′RACE Olig(T)-Adaptor 0.5 5′RACE Adaptor 0.5 P1 0.5 模板 1 ddH2O 2.5 高保真酶 5 条件：95°，5min；98°，10s；57°，5s；72°，1min 30s；72°，5min；4°，Forever 循环数：33 参考原理：共设计 4 条引物,P2 、P1 、 5′RACE Olig(T)-Adaptor 和5′RACE Adaptor, 其中 P1 和 P2 是根据已获得中间片段序列而设计的特异性引物, 并且P2 在P1的下游; 5′RACE Olig(T)-Adaptor 和 5′RACE Adaptor 是一对通用引物。首先, 反转录, 用特异性引物 P2代替反转录试剂盒中的Olig(T)在逆转录酶的作用下合成cDNA 的第一链, 用纯化试剂盒将 cDNA纯化; 其次, 在纯化产物 cDNA3′端加一个Poly(A)尾巴。取纯化 cDNA 10 μL, 5×TdT buffer 10 μL,0.1% BSA 5μL, dATP (10 mmol/L) 2.5 μL, TdT 酶1 μL, H2O 21.5 μL, 37℃ 保温 30 min 后 80℃ 终止反应 3 min。产物用 H2O 稀释为1X，10X，100X 后−20℃ 保存。  5端简易RACE.jpg |
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lansong9783
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2楼2015-05-11 04:11:32
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