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luffyheipi

银虫 (初入文坛)

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虫号: 2034596
注册: 2012-09-27
专业: 生物化学

[求助] 关于构建基因文库中Sau3AI ， BamHI 均切不动基因组DNA的问题。已有2人参与

大家好！
本人初次在小木虫上发帖，各方面如有不当之处，还望大家包涵。先行谢过了！
我最近在构建一株细菌的基因组文库，大量抽提了基因组DNA 5次，每次DNA的浓度均在1000-2000ng/ul之间，A260/280都在1.8-2.0之间，A260/230也都大于2.0.跑胶检测，条带很亮，均一，无拖带。
然后，问题来了。用Sau3AI预酶切时，酶切体系是20ul。但是，酶的稀释比例从5-50倍，酶量2ul，时间从15-120min都试过，几乎都切不动，酶是新买的。少有的切动的情况，想再次重复也重复不出来。之后，改用BamHI，50ul体系，3ul的酶，其他是buffer和DNA。酶切时间从8-24h也都切不动。于是，想检测一下基因组DNA有没有什么问题。用基因组DNA作模板，通用引物扩增16S rDNA，都能扩增出来。用DpnI酶切基因组DNA 1h，也切不动。
以上是我遇到的问题，以及尝试解决问题所做的努力。如有叙述不清楚之处，也请见谅！
恳请有这方面的经验的高手能给我一些指点和建议。将不胜感激！

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