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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于构建基因文库中Sau3AI ， BamHI 均切不动基因组DNA的问题。
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luffyheipi

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于构建基因文库中Sau3AI ， BamHI 均切不动基因组DNA的问题。 已有2人参与

大家好！
   本人初次在小木虫上发帖，各方面如有不当之处，还望大家包涵。先行谢过了！
   我最近在构建一株细菌的基因组文库，大量抽提了基因组DNA 5次，每次DNA的浓度均在1000-2000ng/ul之间，A260/280都在1.8-2.0之间，A260/230也都大于2.0.跑胶检测，条带很亮，均一，无拖带。
   然后，问题来了。用Sau3AI预酶切时，酶切体系是20ul。但是，酶的稀释比例从5-50倍，酶量2ul，时间从15-120min都试过，几乎都切不动，酶是新买的。少有的切动的情况，想再次重复也重复不出来。之后，改用BamHI，50ul体系，3ul的酶，其他是buffer和DNA。酶切时间从8-24h也都切不动。于是，想检测一下基因组DNA有没有什么问题。用基因组DNA作模板，通用引物扩增16S rDNA，都能扩增出来。用DpnI酶切基因组DNA 1h，也切不动。
   以上是我遇到的问题，以及尝试解决问题所做的努力。如有叙述不清楚之处，也请见谅！
   恳请有这方面的经验的高手能给我一些指点和建议。将不胜感激！
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1楼 2015-05-08 09:59:29
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tmoonday

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
luffyheipi: 金币+10, ★有帮助, 好吧，我试试。 2015-05-08 10:48:04
同学我很同情你，建议你试试HindIII限制性内切酶。
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等一份缘分
2楼2015-05-08 10:41:36
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Nabarro

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

Sau对细菌上的甲基化酶敏感，换个酶吧，你可以百度一下Sau内切酶了解一下，再百度甲基化酶了解一下。
赞一下 回复此楼
3楼2015-11-13 21:36:35
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