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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求助！蛋白质切掉GST tag后沉了
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haozy87

金虫 (小有名气)

[求助] 求助！蛋白质切掉GST tag后沉了 已有1人参与

我在BL21里表达GST-RASSF1A ，谷胱甘肽洗脱后，酶切切掉GST，蛋白就沉了（蛋白PI 9.25），是buffer不对吗？如何筛选合适的buffer？另外GST-RASSF1A挂在beads上，不用谷胱甘肽洗脱，直接加酶切掉GST，但只elute下少量RASSF1A，大部分还在beads上，如何防止蛋白切掉tag后沉在beads上？如果沉了，怎样洗下来？同样蛋白带His tag，也是相似问题，250mM咪唑只洗脱了一小半蛋白，大部分还在Ni beads上，EDTA也洗不下来（死在beads上的蛋白不做希望），如何避免蛋白沉在Ni beads上？
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不忘初心
1楼 2015-04-17 23:12:50
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的buffer的ph多少？调的离pi远一点试试。按照beeds的说明书操作问题应该不大的。 你的平衡buffer加低浓度咪唑了吗？上样之前也用此含有低浓度咪唑的buffer平衡柱子试试。
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2楼2015-04-19 14:16:53
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haozy87

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-19 14:16:53
你的buffer的ph多少？调的离pi远一点试试。按照beeds的说明书操作问题应该不大的。 你的平衡buffer加低浓度咪唑了吗？上样之前也用此含有低浓度咪唑的buffer平衡柱子试试。

BUffer pH 7.4和7.0都试过，平衡buffer咪唑浓度20mM，beads肯定是要先平衡的。
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不忘初心
3楼2015-04-19 16:48:11
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by haozy87 at 2015-04-19 16:48:11
BUffer pH 7.4和7.0都试过，平衡buffer咪唑浓度20mM，beads肯定是要先平衡的。...

我常用的也是这个条件，出现过beeds聚集成整体的情况，吹散后呈大颗粒状，高浓度咪唑洗脱也没改善，师兄说是beeds被破坏了

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4楼2015-04-19 20:36:53
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haozy87

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-19 20:36:53
我常用的也是这个条件，出现过beeds聚集成整体的情况，吹散后呈大颗粒状，高浓度咪唑洗脱也没改善，师兄说是beeds被破坏了
...

Beads 确实不行了，问题是新beads效果也没提升多少。现在只能再换载体，换表达系统了
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不忘初心
5楼2015-04-20 12:16:44
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by haozy87 at 2015-04-20 12:16:44
Beads 确实不行了，问题是新beads效果也没提升多少。现在只能再换载体，换表达系统了...

最近做的蛋白都是包涵体，郁闷

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6楼2015-04-20 17:55:02
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haozy87

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-20 17:55:02
最近做的蛋白都是包涵体，郁闷
...

换SUMO tag，Arctic表达系统，诱导温度也降低试试吧
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不忘初心
7楼2015-04-20 19:45:35
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
haozy87: 金币+5, ★有帮助 2015-04-22 19:53:22
引用回帖:
7楼: Originally posted by haozy87 at 2015-04-20 19:45:35
换SUMO tag，Arctic表达系统，诱导温度也降低试试吧...

有没有包含体处理比较规范的方法？我的杂蛋白除的不干净。变性离心后有大量胶状沉淀

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8楼2015-04-20 20:11:50
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haozy87

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-20 20:11:50
有没有包含体处理比较规范的方法？我的杂蛋白除的不干净。变性离心后有大量胶状沉淀
...

我们要的都是可溶蛋白，包涵体处理较少，记得溶包涵体之前都要用含Triton的buffer洗至少三遍才用尿素溶，溶的很澄清透明的，建议多洗几遍看看
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不忘初心
9楼2015-04-22 18:46:57
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蕸沫

新虫 (小有名气)
我也遇到了同样的问题，你最后是怎么解决的呢

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10楼2017-04-18 15:01:04
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