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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求助！蛋白质切掉GST tag后沉了
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haozy87

金虫 (小有名气)

[求助] 求助！蛋白质切掉GST tag后沉了 已有1人参与

我在BL21里表达GST-RASSF1A ，谷胱甘肽洗脱后，酶切切掉GST，蛋白就沉了（蛋白PI 9.25），是buffer不对吗？如何筛选合适的buffer？另外GST-RASSF1A挂在beads上，不用谷胱甘肽洗脱，直接加酶切掉GST，但只elute下少量RASSF1A，大部分还在beads上，如何防止蛋白切掉tag后沉在beads上？如果沉了，怎样洗下来？同样蛋白带His tag，也是相似问题，250mM咪唑只洗脱了一小半蛋白，大部分还在Ni beads上，EDTA也洗不下来（死在beads上的蛋白不做希望），如何避免蛋白沉在Ni beads上？
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不忘初心
1楼 2015-04-17 23:12:50
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by haozy87 at 2015-04-19 16:48:11
BUffer pH 7.4和7.0都试过，平衡buffer咪唑浓度20mM，beads肯定是要先平衡的。...

我常用的也是这个条件，出现过beeds聚集成整体的情况，吹散后呈大颗粒状，高浓度咪唑洗脱也没改善，师兄说是beeds被破坏了

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2015-04-19 20:36:53
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的buffer的ph多少？调的离pi远一点试试。按照beeds的说明书操作问题应该不大的。 你的平衡buffer加低浓度咪唑了吗？上样之前也用此含有低浓度咪唑的buffer平衡柱子试试。
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2楼2015-04-19 14:16:53
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haozy87

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-19 14:16:53
你的buffer的ph多少？调的离pi远一点试试。按照beeds的说明书操作问题应该不大的。 你的平衡buffer加低浓度咪唑了吗？上样之前也用此含有低浓度咪唑的buffer平衡柱子试试。

BUffer pH 7.4和7.0都试过，平衡buffer咪唑浓度20mM，beads肯定是要先平衡的。
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不忘初心
3楼2015-04-19 16:48:11
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haozy87

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-19 20:36:53
我常用的也是这个条件，出现过beeds聚集成整体的情况，吹散后呈大颗粒状，高浓度咪唑洗脱也没改善，师兄说是beeds被破坏了
...

Beads 确实不行了，问题是新beads效果也没提升多少。现在只能再换载体，换表达系统了
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不忘初心
5楼2015-04-20 12:16:44
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