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haozy87

金虫 (小有名气)

[求助] 求助!蛋白质切掉GST tag后沉了 已有1人参与

我在BL21里表达GST-RASSF1A ,谷胱甘肽洗脱后,酶切切掉GST,蛋白就沉了(蛋白PI 9.25),是buffer不对吗?如何筛选合适的buffer?另外GST-RASSF1A挂在beads上,不用谷胱甘肽洗脱,直接加酶切掉GST,但只elute下少量RASSF1A,大部分还在beads上,如何防止蛋白切掉tag后沉在beads上?如果沉了,怎样洗下来?同样蛋白带His tag,也是相似问题,250mM咪唑只洗脱了一小半蛋白,大部分还在Ni beads上,EDTA也洗不下来(死在beads上的蛋白不做希望),如何避免蛋白沉在Ni beads上?
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不忘初心
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by haozy87 at 2015-04-19 16:48:11
BUffer pH 7.4和7.0都试过,平衡buffer咪唑浓度20mM,beads肯定是要先平衡的。...

我常用的也是这个条件,出现过beeds聚集成整体的情况,吹散后呈大颗粒状,高浓度咪唑洗脱也没改善,师兄说是beeds被破坏了

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2015-04-19 20:36:53
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的buffer的ph多少?调的离pi远一点试试。按照beeds的说明书操作问题应该不大的。 你的平衡buffer加低浓度咪唑了吗?上样之前也用此含有低浓度咪唑的buffer平衡柱子试试。
2楼2015-04-19 14:16:53
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haozy87

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-19 14:16:53
你的buffer的ph多少?调的离pi远一点试试。按照beeds的说明书操作问题应该不大的。 你的平衡buffer加低浓度咪唑了吗?上样之前也用此含有低浓度咪唑的buffer平衡柱子试试。

BUffer pH 7.4和7.0都试过,平衡buffer咪唑浓度20mM,beads肯定是要先平衡的。
不忘初心
3楼2015-04-19 16:48:11
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haozy87

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-19 20:36:53
我常用的也是这个条件,出现过beeds聚集成整体的情况,吹散后呈大颗粒状,高浓度咪唑洗脱也没改善,师兄说是beeds被破坏了
...

Beads 确实不行了,问题是新beads效果也没提升多少。现在只能再换载体,换表达系统了
不忘初心
5楼2015-04-20 12:16:44
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