应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求助！蛋白质切掉GST tag后沉了
51/1返回列表
查看: 1624  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

haozy87

金虫 (小有名气)

[求助] 求助！蛋白质切掉GST tag后沉了 已有1人参与

我在BL21里表达GST-RASSF1A ，谷胱甘肽洗脱后，酶切切掉GST，蛋白就沉了（蛋白PI 9.25），是buffer不对吗？如何筛选合适的buffer？另外GST-RASSF1A挂在beads上，不用谷胱甘肽洗脱，直接加酶切掉GST，但只elute下少量RASSF1A，大部分还在beads上，如何防止蛋白切掉tag后沉在beads上？如果沉了，怎样洗下来？同样蛋白带His tag，也是相似问题，250mM咪唑只洗脱了一小半蛋白，大部分还在Ni beads上，EDTA也洗不下来（死在beads上的蛋白不做希望），如何避免蛋白沉在Ni beads上？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
不忘初心
1楼 2015-04-17 23:12:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

haozy87

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-20 20:11:50
有没有包含体处理比较规范的方法？我的杂蛋白除的不干净。变性离心后有大量胶状沉淀
...

我们要的都是可溶蛋白，包涵体处理较少，记得溶包涵体之前都要用含Triton的buffer洗至少三遍才用尿素溶，溶的很澄清透明的，建议多洗几遍看看
赞一下 回复此楼
不忘初心
9楼2015-04-22 18:46:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的buffer的ph多少？调的离pi远一点试试。按照beeds的说明书操作问题应该不大的。 你的平衡buffer加低浓度咪唑了吗？上样之前也用此含有低浓度咪唑的buffer平衡柱子试试。
赞一下 回复此楼
2楼2015-04-19 14:16:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

haozy87

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-04-19 14:16:53
你的buffer的ph多少？调的离pi远一点试试。按照beeds的说明书操作问题应该不大的。 你的平衡buffer加低浓度咪唑了吗？上样之前也用此含有低浓度咪唑的buffer平衡柱子试试。

BUffer pH 7.4和7.0都试过，平衡buffer咪唑浓度20mM，beads肯定是要先平衡的。
赞一下 回复此楼
不忘初心
3楼2015-04-19 16:48:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mlbiosci

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by haozy87 at 2015-04-19 16:48:11
BUffer pH 7.4和7.0都试过，平衡buffer咪唑浓度20mM，beads肯定是要先平衡的。...

我常用的也是这个条件，出现过beeds聚集成整体的情况，吹散后呈大颗粒状，高浓度咪唑洗脱也没改善，师兄说是beeds被破坏了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2015-04-19 20:36:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 081700 调剂 267分 +11 迷人的哈哈 2026-03-23 11/550 2026-03-26 15:41 by zzll406
[考研] 材料科学与工程 317求调剂 +3 JKSOIID 2026-03-26 3/150 2026-03-26 15:40 by 无际的草原
[考研] 总分293求调剂 +6 加一一九 2026-03-25 8/400 2026-03-26 13:30 by yujianx
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 考研一志愿苏州大学初始315（英一）求调剂 +3 sbdksD 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:16 by xcjcqu
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 材料调剂 +3 iwinso 2026-03-23 3/150 2026-03-25 11:29 by greychen00
[考研] 材料学求调剂 +6 Stella_Yao 2026-03-20 6/300 2026-03-25 00:37 by baoball
[考研] 材料调剂 +6 匹克i 2026-03-23 6/300 2026-03-24 21:09 by greychen00
[考研] 0856材料专硕353求调剂 +6 NIFFFfff 2026-03-20 6/300 2026-03-24 21:02 by hello七七
[考研] 一志愿南航材料专317分求调剂 +5 炸呀炸呀炸薯条 2026-03-23 5/250 2026-03-24 16:52 by 星空星月
[考研] 环境学硕288求调剂 +8 皮皮皮123456 2026-03-22 8/400 2026-03-23 23:47 by 热情沙漠
[考研] 361求调剂 +3 Glack 2026-03-22 3/150 2026-03-23 22:03 by fuyu_
[考研] 接收2026硕士调剂(学硕+专硕) +4 allen-yin 2026-03-23 6/300 2026-03-23 15:04 by 汪！？！
[考研] 一志愿070300浙大化学358分，求调剂！ +4 酥酥鱼.. 2026-03-21 4/200 2026-03-23 08:12 by Iveryant
[考研] 280分求调剂 一志愿085802 +4 PUMPT 2026-03-22 7/350 2026-03-22 22:13 by 星空星月
[考研] 085600材料与化工306 +4 z1z2z3879 2026-03-21 4/200 2026-03-21 23:44 by ms629
[考研] 336求调剂 +5 rmc8866 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:24 by 学员8dgXkO
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境总分308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-20 7/350 2026-03-21 16:36 by barlinike
[考研] 265求调剂 +12 梁梁校校 2026-03-19 14/700 2026-03-21 13:38 by lature00
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭