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limi的猜想

新虫 (初入文坛)

[求助] 贴壁细胞mtt试验原理及方法步骤 已有1人参与

贴壁细胞mtt试验原理及方法步骤是什么？新手，希望大神们说的详细点，谢谢！
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1楼 2015-03-16 12:54:11
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0724410016

新虫 (小有名气)
做什么细胞的MTT检测啊？可以包出去做的，我之前在齐氏生物做的，结果挺好的，周期快，价格实惠。
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2楼2015-03-16 13:00:21
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20090806215

新虫 (初入文坛)
MTT原理
 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm
波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗
肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
普通MTT法实验步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤
贴壁细胞：
1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
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3楼2015-03-16 13:09:44
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昵称最头疼

新虫 (初入文坛)
自己照着网上的方法实验，关键是要摸索的一个过程。或者你可以打电话请教下专门做技术实验的公司，问问一家叫齐氏生物的公司，感觉专业和服务都还不错呢，里面的实验员经验肯定比我们丰富。
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4楼2015-03-16 13:28:09
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lidong.0107

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
每个实验室的条件不同，做的方法也不同，主要的原理就是MTT与DMSO，你要先摸索下条件，成熟后很快的！加油~~~
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5楼2015-03-17 10:43:50
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