| 查看: 1082 | 回复: 4 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
贴壁细胞mtt试验原理及方法步骤已有1人参与
|
||
贴壁细胞mtt试验原理及方法步骤是什么？新手，希望大神们说的详细点，谢谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
投稿精细化工
已经有6人回复
-
博士读完未来一定会好吗
已经有36人回复
-
之前让一硕士生水了7个发明专利，现在这7个获批发明专利的维护费可从哪儿支出哈？
已经有10人回复
-
博士申请都是内定的吗？
已经有9人回复
-
心脉受损
已经有8人回复
-
读博
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
MTT做细胞毒性测试问题
已经有14人回复- MTT测细胞生长曲线
已经有5人回复
- MTT法测细胞活力
已经有10人回复
- 悬浮细胞MTT法求助
已经有18人回复
- 关于MTT毒性实验的，正常细胞选择何种细胞
已经有7人回复
- 药物对细胞毒性的实验方法
已经有9人回复
- 做MTT实验 细胞铺板总是不均匀 有何良方解决
已经有8人回复
- 关于悬浮细胞MTT的一点疑问，求解答！
已经有11人回复
- MTT实验 有些用490nm， 有些用570nm 测定，有啥区别？
已经有3人回复
- MTT实验数据处理
已经有11人回复
- 请教关于MTT脾淋巴细胞增殖问题
已经有11人回复
- 关于细胞毒性MTT实验
已经有12人回复
- 【求助/交流】MTT实验中加MTT不显紫色
已经有24人回复
- 【求助/交流】MTT实验酶标仪波长选择
已经有3人回复
- 【求助】MTT法细胞毒性试验
已经有3人回复
lidong.0107
铜虫 (小有名气)
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 359
- 散金: 25
- 帖子: 84
- 在线: 77.6小时
- 虫号: 879140
- 注册: 2009-10-21
- 性别: MM
- 专业: 蛋白质组学
5楼2015-03-17 10:43:50
0724410016
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 500.2
- 红花: 1
- 帖子: 71
- 在线: 20.1小时
- 虫号: 3677467
- 注册: 2015-02-04
- 专业: 细胞生长与分裂
2楼2015-03-16 13:00:21
|
MTT原理 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗 肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。 普通MTT法实验步骤： 1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul. 2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。 4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 药物MTT法实验步骤 贴壁细胞： 1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。 |
3楼2015-03-16 13:09:44
4楼2015-03-16 13:28:09