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【求助】蛋白含量测定
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请问： 用考马斯亮蓝法测商品酶的蛋白含量，结果不显色，吸光度为0，有谁知道请指教，谢谢。 [ Last edited by yusen_1982 on 2009-3-24 at 22:01 ] |
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fenglianxiang
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2楼2008-06-11 09:06:56
l379989165
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heavence007(金币+1,VIP+0):谢谢分享答案
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| 可以先检查一下试剂或仪器有没有问题了。操作如果也没失误的话应该不会有什么问题的。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 |
3楼2008-06-11 13:49:12
4楼2008-06-11 19:41:00
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6楼2009-04-02 14:28:03
winter_gates
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9楼2009-04-10 12:40:41
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可溶性总蛋白含量按Bradford [1]的方法进行测定，以牛血清蛋白为标准蛋白，测定不同标准蛋白浓度的A595值，做标准曲线，根据标准曲线计算未知蛋白的浓度。标准蛋白质溶液为1000μg／mL牛血清白蛋白：称取牛血清蛋白5mg，加水溶解并定容至5mL即可。考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入100mL 85％(W／V)的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中（常温下可保存一个月）。 取12支试管，分两组平行按照下表进行加样并测定595nm处的吸光度值，结果见表1。 表1 牛血清白蛋白标准曲线(OD)A595 Table1．Standard curve (OD) at A595 value with Bovine serum albumin 管号 1 2 3 4 5 6 BSA用量（ul） 0 10 20 30 40 50 水（ul) 500 490 480 470 460 450 考马斯亮蓝G 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 -250溶液（ml） A595 0 0.113 0.206 0.301 0.413 0.507 绘制标准曲线：以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线图： |
10楼2009-04-21 00:47:24
