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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 金属生物材料 » 【求助】蛋白含量测定
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cily1986

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助】蛋白含量测定

请问：
    用考马斯亮蓝法测商品酶的蛋白含量，结果不显色，吸光度为0，有谁知道请指教，谢谢。

[ Last edited by yusen_1982 on 2009-3-24 at 22:01 ]
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1楼 2008-06-10 23:59:17
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fenglianxiang

木虫 (著名写手)

WWE王中王HHH
详细看看是不是哪个条件或者步骤有误。要不就是你这个酶有问题了
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2楼2008-06-11 09:06:56
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l379989165

金虫 (正式写手)

水晶
★ ★
heavence007(金币+1,VIP+0):谢谢分享答案
薰衣草儿(金币+1,VIP+0):回答很精彩，再奖，生物材料版期待您更多的参与！ 5-25 14:53
可以先检查一下试剂或仪器有没有问题了。操作如果也没失误的话应该不会有什么问题的。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
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来是偶然，去是必然，尽其当然，顺其自然。得之淡然，失之泰然，争其必然，自然而然。
3楼2008-06-11 13:49:12
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cily1986

金虫 (小有名气)
★
heavence007(金币+1,VIP+0):谢谢分享答案
用所配的考马斯亮蓝以牛血清蛋白为标准品能作出标准曲线，而且所买的商品酶经测定是有酶活的。我觉得是不是pH值的影响，可能该蛋白质的等电点在酸性范围内，有可能该蛋白质恰好不带电荷。
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4楼2008-06-11 19:41:00
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fak

木虫 (小有名气)

会不会是加入的酶浓度太低了

★
yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎分享经验 3-24 21:57
我也曾经用Bradford法定量过蛋白浓度，发现如果加入的蛋白量太少，595nm吸光度就接近0了，你可以加大酶的量再测一下595 nm吸光度
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5楼2009-03-24 19:19:36
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无知3096

木虫 (小有名气)
wgcui(金币+0,VIP+0):欢迎讨论！ 4-21 08:51
酶的浓度太低了吧 有些商品酶本身是高纯的 含有的蛋白非常少
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一起前进吧！
6楼2009-04-02 14:28:03
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
wgcui(金币+0,VIP+0):欢迎讨论！ 4-21 08:51
楼上！我太无语了，你太牛了！我还是头一次听说有商品化的非蛋白-酶制剂（如果硬说某些核酸是酶的话，我也噎着吧）。老大，酶就是蛋白，蛋白质的一种罢了。严格来说，根本不存在非蛋白质的enzyme（ribozyme除外了）。
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For my life！
7楼2009-04-02 16:33:31
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
★
yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎应助 4-2 17:16
还有，再回楼主，我真的不明白你所说的，即便是不显色也是有颜色的啊，怎么可能没有吸光值？室温放置一会儿吸光值就会有变化，更不用提按标准操作的时间后了。一般测定的时候一定要有空白对照，最后是需要扣除的。
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For my life！
8楼2009-04-02 16:35:51
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者
★ ★
yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎应助 4-10 16:20
yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎应助 4-10 16:20
引用回帖:
Originally posted by cily1986 at 2008-6-11 19:41:
用所配的考马斯亮蓝以牛血清蛋白为标准品能作出标准曲线，而且所买的商品酶经测定是有酶活的。我觉得是不是pH值的影响，可能该蛋白质的等电点在酸性范围内，有可能该蛋白质恰好不带电荷。

很可能的原因是：酶本身的质量含量低，但酶的比活性高，例如100 ug/L 就有10000000000000000 U/L的酶活。你当然测不到其蛋白浓度了，但活性大大滴
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
9楼2009-04-10 12:40:41
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fcy9225

金虫 (小有名气)
★ ★
wgcui(金币+0,VIP+0):欢迎讨论！ 4-21 08:51
薰衣草儿(金币+1,VIP+0):谢谢回答，生物材料版期待您更多的参与！ 5-25 14:29
薰衣草儿(金币+1,VIP+0):回答很精彩，再奖，生物材料版期待您更多的参与！ 5-25 14:54
可溶性总蛋白含量按Bradford [1]的方法进行测定，以牛血清蛋白为标准蛋白，测定不同标准蛋白浓度的A595值，做标准曲线，根据标准曲线计算未知蛋白的浓度。标准蛋白质溶液为1000μg／mL牛血清白蛋白：称取牛血清蛋白5mg，加水溶解并定容至5mL即可。考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入100mL 85％(W／V)的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中（常温下可保存一个月）。
取12支试管，分两组平行按照下表进行加样并测定595nm处的吸光度值，结果见表1。
表1 牛血清白蛋白标准曲线(OD)A595
Table1．Standard curve (OD) at A595 value with Bovine serum albumin
管号                    1          2         3           4           5          6
BSA用量（ul）           0          10        20          30          40         50
水（ul)                  500        490       480         470         460        450

考马斯亮蓝G             4.5        4.5        4.5         4.5          4.5        4.5
-250溶液（ml）
   
A595                    0         0.113      0.206       0.301         0.413    0.507

绘制标准曲线：以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线图：
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10楼2009-04-21 00:47:24
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