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IMichaelhan木虫 (小有名气)
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mtDNA提取问题 已有1人参与
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试剂： 溶液A:含Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 10mmol/L, MgCl2 5mmol/L， pH7.5; 溶液B:Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 400mmol/L,EDTA 2mmol/L， pH8.0; 10%SDS溶液 提取步骤： 1、取冷冻组织用液氮研磨,加入溶液A 500ul, 混匀, 2000r/min,10min,弃上清。 2、沉淀加溶液B 500ul, 混匀, 3500r/min,10min,弃上清。 3、沉淀加溶液B 100ul,混匀后加入蛋白酶K 5ul和10%SDS 20ul, 快速混匀。40℃过夜或50℃4h。 4、加入50ul饱和醋酸钠,混匀,轻摇15S。15000r/min, 4℃, 15min,取上清液。 5、重复步骤4 6、取上清，加入等体积酚∶氯仿∶异醇(25∶24∶1),温和振荡5min, 10000r/min,10min, 4℃ 7、重复步骤6 8、加入2倍体积冰乙醇冰浴30min, 15000r/min, 10min, 弃上清。 9、用70%冰乙醇漂洗沉淀,15000r/min, 2min, 彻底去上清。沉淀于空气中干燥25min, 加入适量50ul ddH2O液溶解。贮于4℃ 我提取的是动物的mtDNA，郁闷的是提了好几次，OD值1.8-2.0之间，浓度也可以，但是电泳检测之后没有目的条带，降解也很严重，问题出在哪啊？破碎组织时试过用剪刀、电动研磨棒、液氮研磨，结果没有目的条带，每一步我都是在冰上做的，也一样。我觉得总归是DNA，没那么容易降解吧。还是我的方法出了错，请高手指点 |
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新虫 (小有名气)
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