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IMichaelhan

木虫 (小有名气)

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注册: 2013-03-12
专业: 生物物理、生物化学与分子

[求助] mtDNA提取问题已有1人参与

试剂：
溶液A:含Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 10mmol/L,  MgCl2 5mmol/L， pH7.5;
溶液B:Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 400mmol/L,EDTA 2mmol/L，    pH8.0;
10%SDS溶液
提取步骤：
1、取冷冻组织用液氮研磨,加入溶液A 500ul, 混匀, 2000r/min,10min,弃上清。
2、沉淀加溶液B  500ul, 混匀, 3500r/min,10min,弃上清。
3、沉淀加溶液B 100ul,混匀后加入蛋白酶K 5ul和10%SDS 20ul, 快速混匀。40℃过夜或50℃4h。
4、加入50ul饱和醋酸钠,混匀,轻摇15S。15000r/min, 4℃, 15min,取上清液。
5、重复步骤4
6、取上清，加入等体积酚∶氯仿∶异醇(25∶24∶1),温和振荡5min, 10000r/min,10min, 4℃
7、重复步骤6
8、加入2倍体积冰乙醇冰浴30min, 15000r/min, 10min, 弃上清。
9、用70%冰乙醇漂洗沉淀,15000r/min,  2min, 彻底去上清。沉淀于空气中干燥25min, 加入适量50ul ddH2O液溶解。贮于4℃

我提取的是动物的mtDNA，郁闷的是提了好几次，OD值1.8-2.0之间，浓度也可以，但是电泳检测之后没有目的条带，降解也很严重，问题出在哪啊？破碎组织时试过用剪刀、电动研磨棒、液氮研磨，结果没有目的条带，每一步我都是在冰上做的，也一样。我觉得总归是DNA，没那么容易降解吧。还是我的方法出了错，请高手指点

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生物信息学专题－生物版，医学版和信息科学版共同创建已经有87人回复

1楼 2014-12-17 18:39:55

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xuxiaokun313

新虫 (小有名气)

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专业: 病原细菌与放线菌生物学

【答案】应助回帖

不知道你的提取方法是从哪里来的，推荐一篇文献，里面的提取方法很经典
Ef®cient cloning and engineering of entire mitochondrial genomes in Escherichia coli and transfer into transcriptionally active mitochondria