| 查看: 1249 | 回复: 2 | ||
[求助]
新手求问Western Blot中裂解细胞、抗体选择、转膜、磷酸化蛋白检测等问题 已有2人参与
|
|
要毕业啦，可是还有一部分实验需要用Western Blot，才刚开始学，那个急啊！上手遇到各种问题。 其一，在裂解细胞收集蛋白时，我用的是碧云天的RIPA裂解液，先加了PMSF和蛋白酶抑制剂分装与-20保存的，临用前解冻加入磷酸酶抑制剂，但我看网上写的PMSF是需要临用现加的，就不知道我的方法会不会有问题。想问问是不是应该先将蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂加入裂解液中分装保存，临用时再加PMSF呢？ 其二，我用的是碧云天的抗体，不知道该公司的抗体如何啊？我是要检测磷酸化蛋白如P38、ERK、JNK等，听说磷酸化蛋白不是很好做，这几个呢？如果国产抗体不好，哪些公司的抗体会好一些？磷酸化蛋白检测需要注意些什么问题？ 其三，就是我实验中遇到的问题了……我同时做了两块胶，在转膜时同一个三明治里面放的，即两张海绵/两张滤纸/胶/膜/两张滤纸/一张海绵/两张滤纸/胶/膜/两张滤纸/两张海绵，300mA, 2h，很神奇的是靠近负极的那张胶全转到膜上了，靠近正极的却只转了一部分，这是什么原因啊？ 此外，我还遇到一个问题，用ECL显色5min后放入bio-rad凝胶成像系统中显影，发现显色过久的话那个试剂基本上就嵌入膜里了，根本无法用一抗二抗去除液洗掉，这个时候该怎么办呢？如果strip液洗太久会不会把蛋白也给洗下来了？ 好纠结啊，没有多少时间可以慢慢做实验了，还请各位高手指教啊！ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有64人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请教有关Westen Blot抗体有关的问题
已经有16人回复
- Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
已经有37人回复
- WB结果不理想，呼唤帮助
已经有20人回复
- Western Blot 磷酸化蛋白测定问题
已经有9人回复
上张图吧，砖模反了，估计是黑胶白膜没放对，或者电极放错了，多问实验室师兄师姐啊，我都是临时加PMSF，你是AP,,还是HRP显色，看到目的条带，水冲就可以终止显色啊，多和实验室师兄师姐交流啊 
2楼2014-11-05 19:03:10
3楼2014-11-14 14:07:19
