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七星草

银虫 (小有名气)

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[求助] 新手求问Western Blot中裂解细胞、抗体选择、转膜、磷酸化蛋白检测等问题已有2人参与

要毕业啦，可是还有一部分实验需要用Western Blot，才刚开始学，那个急啊！上手遇到各种问题。
其一，在裂解细胞收集蛋白时，我用的是碧云天的RIPA裂解液，先加了PMSF和蛋白酶抑制剂分装与-20保存的，临用前解冻加入磷酸酶抑制剂，但我看网上写的PMSF是需要临用现加的，就不知道我的方法会不会有问题。想问问是不是应该先将蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂加入裂解液中分装保存，临用时再加PMSF呢？
其二，我用的是碧云天的抗体，不知道该公司的抗体如何啊？我是要检测磷酸化蛋白如P38、ERK、JNK等，听说磷酸化蛋白不是很好做，这几个呢？如果国产抗体不好，哪些公司的抗体会好一些？磷酸化蛋白检测需要注意些什么问题？
其三，就是我实验中遇到的问题了……我同时做了两块胶，在转膜时同一个三明治里面放的，即两张海绵/两张滤纸/胶/膜/两张滤纸/一张海绵/两张滤纸/胶/膜/两张滤纸/两张海绵，300mA, 2h，很神奇的是靠近负极的那张胶全转到膜上了，靠近正极的却只转了一部分，这是什么原因啊？
此外，我还遇到一个问题，用ECL显色5min后放入bio-rad凝胶成像系统中显影，发现显色过久的话那个试剂基本上就嵌入膜里了，根本无法用一抗二抗去除液洗掉，这个时候该怎么办呢？如果strip液洗太久会不会把蛋白也给洗下来了？

好纠结啊，没有多少时间可以慢慢做实验了，还请各位高手指教啊！

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