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汕头大学海洋科学接受调剂
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奇怪人生123

银虫 (小有名气)

[求助] 构建丝状真菌转化子,产生一个没有终止子的基因,请问它会如何转录和表达?求大神! 已有1人参与

我一直在做灰绿曲霉的相关研究,为了将我的目的蛋白与GFP融合表达,所以构建一个叫做pXL-zeo的质粒,通过单交换获得转化子,见我的附件图。
最上方的是我构建的质粒,中间写有“WT”的是野生株的基因组,最下方“NEW TYPE”指得到的转化子的基因型。
对于转化子的基因型,在前面的部位产生了一个有启动子+目的基因完整ORF(但没有终止子)的“基因”,紧跟其后的是构建质粒上的一部分序列,在后面的一坨就是抗性基因和我想要的表达盒。
那么问题来了!前方“启动子+目的基因完整ORF”会如何转录及表达呢?希望各位大神能稍详尽的分析,最好能有一些资料。

PS:我对目的基因和gfp做了Real-time PCR,得到目的基因veA表达量非常高,gfp表达量相对低,但是通过转化子的表型分析,该转化子更像是目的基因功能缺失的菌株。

构建丝状真菌转化子,产生一个没有终止子的基因,请问它会如何转录和表达?求大神!
单交换.png
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实时荧光定量PCR(TaqMan探针法)欢迎和大家探讨~
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奇怪人生123

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bolysu at 2014-10-25 10:53:23
不知道你在做定量PCR时,是否选择的是目的基因的一小段?在进行单交换时,并不是整个目的基因完整的交换,而是一部分交换,这样也可以达到整个质粒插入的,你的很有可能是部分交换,导致表达终止,可以用完整的引物 ...

1. 定量PCR时,确实是目的基因的一段,大概90bp左右。另外我也都对gfp基因做了定量PCR,二者的表达量差别很大。
2. 关于单交换,你说的很对  只是在我构建的质粒pXL-zeo上,基因的ORF是完整的,如果与菌基因组里的ORF单交换的话,应该会形成两个完整的目的基因ORF的吧。。。对于验证,我都已经做过了,是上图所示的状况!
实时荧光定量PCR(TaqMan探针法)欢迎和大家探讨~
3楼2014-10-27 12:11:50
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bolysu

禁虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
奇怪人生123: 金币+5, 有帮助 2014-10-27 12:12:09
本帖内容被屏蔽

2楼2014-10-25 10:53:23
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