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分析-Legion

新虫 (小有名气)

[求助] SYBR Green I 会与ExoIII 之间会相互影响吗

1.在缓冲液中加入SYBR Green I 可以检测到较高的荧光强度(1379 au.);当在缓冲液中加入ExoIII,水浴37℃后再加入SYBR Green I 十分钟后检测荧光强度时只有198.4.这可以说明ExoIII会和SYBR Green I反应吗?
2..我在加入Exo III 37摄氏度培育半个小时后 又将这个酶灭活了20min ,最后加入染料SG I,十分钟后检测荧光,荧光值还是很低,只有100多。应该怎么样才可以降低Exo III对SYBR Green I 的影响呢?
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分析-Legion

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 09mzone at 2014-10-17 22:27:00
SYBR Green I 是要嵌入dsDNA以后才能发出荧光
ExoIII可以剪切3'到5'的dsDNA
所以SYBR Green I 在含有dsDNA中,会发强荧光,当有ExoIII存在时候,dsDNA被切断,荧光就没了。

我做的是让SYBR Green I 嵌入G四联体里面发光,实验证明G四联体越多,加入相同量的SYBR Green I 得到的荧光强度也是越大的。
另外,我做的另一个实验:在形成G四联体后(G四浓度不断增加)加入相同量的Exo III 培育(目的是想证明Exo III不能水解G四联体),再加入相同量的SYBR Green I 培育就不会有逐渐增强的荧光强度,实验现象是在低浓度范围荧光强度都很低(接近于水平线),在中间浓度时(5mM)荧光强度达到最高值,然后随着G四浓度的增大,荧光强度是不断降低的。
这个实验我已经重复了很多次,每次都是这种现象,这是什么原因呢,是因为Exo III可能已经剪切了G四联体吗?
努力向前,珍惜拥有。
3楼2014-10-18 09:54:01
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09mzone

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

SYBR Green I 是要嵌入dsDNA以后才能发出荧光
ExoIII可以剪切3'到5'的dsDNA
所以SYBR Green I 在含有dsDNA中,会发强荧光,当有ExoIII存在时候,dsDNA被切断,荧光就没了。
strive for excellent!
2楼2014-10-17 22:27:00
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09mzone

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
分析-Legion: 金币+8 2014-10-19 15:18:19
引用回帖:
3楼: Originally posted by 分析-Legion at 2014-10-18 09:54:01
我做的是让SYBR Green I 嵌入G四联体里面发光,实验证明G四联体越多,加入相同量的SYBR Green I 得到的荧光强度也是越大的。
另外,我做的另一个实验:在形成G四联体后(G四浓度不断增加)加入相同量的Exo III 培 ...

我觉得应该是固定G四,改变EXO3,再加入相同的SYBR Green1
strive for excellent!
4楼2014-10-18 23:40:16
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更深的蓝

铁杆木虫 (正式写手)

EXOIII没有不是严格的切割双链,实际上也能降解单链的,出现这种情况,应该是你的G4被EXOIII降解了,你可以跑个PAGE胶验证一下。
低调务实!
5楼2014-10-20 08:58:35
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