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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

[求助] 求大神,蛋白质纯化过程如何解决降解和沉淀 已有4人参与

我在His亲和过程中总是出现蛋白降解,我该如何解决啊
还有一个蛋白,浓度稍高点就沉淀了,咪唑洗脱下来的就是沉淀悬浮状了,看着这蛋白真心疼啊
大家有没有什么好办法,指点一下小弟
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eagleeyess

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

关于降解,从三个方面考虑,一是温度,尽量低温;二是蛋白酶抑制剂,单一种类效果有限,最好混合用;三是时间,尽量缩短纯化时间。
关于目标蛋白沉淀的问题,可以从这几个方面考虑,一是缓冲体系;二是盐浓度;三,有些蛋白疏水性强,需要加入表面活性剂帮助溶解。还有一些需要特异性的辅助因子来稳定它,比如金属离子,多糖等因素。
希望对你有帮助!
6楼2014-10-11 13:49:53
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guaihaizi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.可以试试加入PMSF,最好是在低温的层析冷柜里操作就更好了,或是开空调控制在22度左右也可以
2.蛋白沉淀与蛋白的性质相关:(因素有很多的)
(1)咪唑所在的缓冲体系的PH太过接近你目的蛋白的等电点PI,比如将PH=7.4的PB缓冲体系换成PH=8.5的Tris-HCl缓冲体系;
(2)蛋白本身含过多半胱氨酸区域等致使蛋白表达过程中折叠不正确;
(3)蛋白疏水区域过多,可以加入10-50%甘油;
(4)缓冲体系中的NaCl的浓度也相关,可适当降低或提高浓度。
2楼2014-10-08 11:23:52
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guaihaizi at 2014-10-08 11:23:52
1.可以试试加入PMSF,最好是在低温的层析冷柜里操作就更好了,或是开空调控制在22度左右也可以
2.蛋白沉淀与蛋白的性质相关:(因素有很多的)
(1)咪唑所在的缓冲体系的PH太过接近你目的蛋白的等电点PI,比如将 ...

我用着PMSF,Nacl用的500mM,

你说 的第一条咪唑的问题,我没看懂,那不是应该接近等电点的吗,为什么要远离?

我用的pH8.0Tris-HCl
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3楼2014-10-08 12:18:51
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
咪唑配制的要远离等电点0.5pH以上,否则会造成蛋白絮凝的。因为蛋白在pI时候曝露很多疏水基团,造成絮凝。
4楼2014-10-08 14:25:39
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