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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求大神，蛋白质纯化过程如何解决降解和沉淀
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

[求助] 求大神，蛋白质纯化过程如何解决降解和沉淀 已有4人参与

我在His亲和过程中总是出现蛋白降解，我该如何解决啊
还有一个蛋白，浓度稍高点就沉淀了，咪唑洗脱下来的就是沉淀悬浮状了，看着这蛋白真心疼啊
大家有没有什么好办法，指点一下小弟
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1楼 2014-10-08 11:01:42
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guaihaizi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.可以试试加入PMSF，最好是在低温的层析冷柜里操作就更好了，或是开空调控制在22度左右也可以
2.蛋白沉淀与蛋白的性质相关：（因素有很多的）
（1）咪唑所在的缓冲体系的PH太过接近你目的蛋白的等电点PI，比如将PH=7.4的PB缓冲体系换成PH=8.5的Tris-HCl缓冲体系；
（2）蛋白本身含过多半胱氨酸区域等致使蛋白表达过程中折叠不正确；
（3）蛋白疏水区域过多，可以加入10-50%甘油；
（4）缓冲体系中的NaCl的浓度也相关，可适当降低或提高浓度。
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2楼2014-10-08 11:23:52
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guaihaizi at 2014-10-08 11:23:52
1.可以试试加入PMSF，最好是在低温的层析冷柜里操作就更好了，或是开空调控制在22度左右也可以
2.蛋白沉淀与蛋白的性质相关：（因素有很多的）
（1）咪唑所在的缓冲体系的PH太过接近你目的蛋白的等电点PI，比如将 ...

我用着PMSF，Nacl用的500mM，

你说 的第一条咪唑的问题，我没看懂，那不是应该接近等电点的吗，为什么要远离？

我用的pH8.0Tris-HCl
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3楼2014-10-08 12:18:51
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
咪唑配制的要远离等电点0.5pH以上，否则会造成蛋白絮凝的。因为蛋白在pI时候曝露很多疏水基团，造成絮凝。
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4楼2014-10-08 14:25:39
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guaihaizi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 火舞精灵3 at 2014-10-08 12:18:51
我用着PMSF，Nacl用的500mM，

你说 的第一条咪唑的问题，我没看懂，那不是应该接近等电点的吗，为什么要远离？

我用的pH8.0Tris-HCl...

亲，接近等电点的话，蛋白还没与Ni柱结合就沉降了，那你还怎么纯化目的蛋白啊？
拿我做实验的例子来说，蛋白溶解在PBS中，260mM咪唑洗脱液的成分：
500mM NaCl,50mM Tris,260mM 咪唑，用HCl调节PH=8.5；
其中PH=8.5 50mM Tris-HCl即为所谓的缓冲体系
(除咪唑和NaCl外起到调节PH作用的成分即为缓冲体系)。
如果说你用PH=8.0的依旧沉淀，可以试试PH=8.5的，其实50mM的Tris-HCl的缓冲能力在PH=8.5为最佳的说。
前提是你跑胶确认沉淀的蛋白即为你的目的蛋白。
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5楼2014-10-09 13:06:47
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eagleeyess

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

关于降解，从三个方面考虑，一是温度，尽量低温；二是蛋白酶抑制剂，单一种类效果有限，最好混合用；三是时间，尽量缩短纯化时间。
关于目标蛋白沉淀的问题，可以从这几个方面考虑，一是缓冲体系；二是盐浓度；三，有些蛋白疏水性强，需要加入表面活性剂帮助溶解。还有一些需要特异性的辅助因子来稳定它，比如金属离子，多糖等因素。
希望对你有帮助！
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6楼2014-10-11 13:49:53
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langzian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人经验，我在肠杆菌表达纯化时，不加酶抑制剂，但我在冰上操作，而且会快速完成上样洗脱，over，没有出现降解

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江山
7楼2014-10-13 23:29:27
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