应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求大神，蛋白质纯化过程如何解决降解和沉淀
71/1返回列表
查看: 1839  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

[求助] 求大神，蛋白质纯化过程如何解决降解和沉淀 已有4人参与

我在His亲和过程中总是出现蛋白降解，我该如何解决啊
还有一个蛋白，浓度稍高点就沉淀了，咪唑洗脱下来的就是沉淀悬浮状了，看着这蛋白真心疼啊
大家有没有什么好办法，指点一下小弟
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

资源

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
翻新核弹头,回收二手航母,大修核反应堆,航天飞机保养换三滤,高空作业擦洗卫星表面积尘,南极冰川修复,提供原子对撞机,提供捕捉反物质原子技术支持
1楼 2014-10-08 11:01:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guaihaizi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.可以试试加入PMSF，最好是在低温的层析冷柜里操作就更好了，或是开空调控制在22度左右也可以
2.蛋白沉淀与蛋白的性质相关：（因素有很多的）
（1）咪唑所在的缓冲体系的PH太过接近你目的蛋白的等电点PI，比如将PH=7.4的PB缓冲体系换成PH=8.5的Tris-HCl缓冲体系；
（2）蛋白本身含过多半胱氨酸区域等致使蛋白表达过程中折叠不正确；
（3）蛋白疏水区域过多，可以加入10-50%甘油；
（4）缓冲体系中的NaCl的浓度也相关，可适当降低或提高浓度。
赞一下 回复此楼
2楼2014-10-08 11:23:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guaihaizi at 2014-10-08 11:23:52
1.可以试试加入PMSF，最好是在低温的层析冷柜里操作就更好了，或是开空调控制在22度左右也可以
2.蛋白沉淀与蛋白的性质相关：（因素有很多的）
（1）咪唑所在的缓冲体系的PH太过接近你目的蛋白的等电点PI，比如将 ...

我用着PMSF，Nacl用的500mM，

你说 的第一条咪唑的问题，我没看懂，那不是应该接近等电点的吗，为什么要远离？

我用的pH8.0Tris-HCl
赞一下 回复此楼
翻新核弹头,回收二手航母,大修核反应堆,航天飞机保养换三滤,高空作业擦洗卫星表面积尘,南极冰川修复,提供原子对撞机,提供捕捉反物质原子技术支持
3楼2014-10-08 12:18:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
咪唑配制的要远离等电点0.5pH以上，否则会造成蛋白絮凝的。因为蛋白在pI时候曝露很多疏水基团，造成絮凝。
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-08 14:25:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guaihaizi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 火舞精灵3 at 2014-10-08 12:18:51
我用着PMSF，Nacl用的500mM，

你说 的第一条咪唑的问题，我没看懂，那不是应该接近等电点的吗，为什么要远离？

我用的pH8.0Tris-HCl...

亲，接近等电点的话，蛋白还没与Ni柱结合就沉降了，那你还怎么纯化目的蛋白啊？
拿我做实验的例子来说，蛋白溶解在PBS中，260mM咪唑洗脱液的成分：
500mM NaCl,50mM Tris,260mM 咪唑，用HCl调节PH=8.5；
其中PH=8.5 50mM Tris-HCl即为所谓的缓冲体系
(除咪唑和NaCl外起到调节PH作用的成分即为缓冲体系)。
如果说你用PH=8.0的依旧沉淀，可以试试PH=8.5的，其实50mM的Tris-HCl的缓冲能力在PH=8.5为最佳的说。
前提是你跑胶确认沉淀的蛋白即为你的目的蛋白。
赞一下 回复此楼
5楼2014-10-09 13:06:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eagleeyess

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

关于降解，从三个方面考虑，一是温度，尽量低温；二是蛋白酶抑制剂，单一种类效果有限，最好混合用；三是时间，尽量缩短纯化时间。
关于目标蛋白沉淀的问题，可以从这几个方面考虑，一是缓冲体系；二是盐浓度；三，有些蛋白疏水性强，需要加入表面活性剂帮助溶解。还有一些需要特异性的辅助因子来稳定它，比如金属离子，多糖等因素。
希望对你有帮助！
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2014-10-11 13:49:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

langzian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人经验，我在肠杆菌表达纯化时，不加酶抑制剂，但我在冰上操作，而且会快速完成上样洗脱，over，没有出现降解

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
江山
7楼2014-10-13 23:29:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 火舞精灵3 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料类284调剂 +32 想换手机不想解� 2026-04-08 37/1850 2026-04-09 23:20 by parmtree
[考研] 一志愿华工085600 331分 +6 天下ww 2026-04-09 6/300 2026-04-09 18:59 by l_paradox
[考研] 一志愿西南大学生物学学硕344 求生物学相关调剂/生物与医药 +7 超人不会飞@ 2026-04-08 7/350 2026-04-09 09:35 by gong120082
[考研] 一志愿211，化学学硕，310分，本科重点双非，求调剂 +20 努力奋斗112 2026-04-07 21/1050 2026-04-08 14:54 by screening
[考研] 298求调剂 +6 钉叮咚冬瓜 2026-04-07 8/400 2026-04-08 10:51 by 中飞院空管学院�
[考研] 323求调剂 +3 林zlu 2026-04-07 4/200 2026-04-07 23:21 by lbsjt
[考研] 313求调剂 +3 十六拾陆 2026-04-07 3/150 2026-04-07 23:20 by lbsjt
[考研] 085602调剂 初试总分335 +10 19123253302 2026-04-05 10/500 2026-04-07 15:23 by 小乔同学ya
[考研] 081700化学工程与技术 一志愿中海洋 323 求调剂学校 +19 披星河 2026-04-03 19/950 2026-04-07 15:14 by 尽舜尧1
[考研] 生物学调剂 可调剂到生物与医药 +3 李政莹 2026-04-06 3/150 2026-04-06 19:02 by macy2011
[考研] 一志愿武汉理工大学080200机械工程308分，求调剂 +4 终不似从前 2026-04-05 4/200 2026-04-06 11:46 by 考研学校招点人
[考研] 求调剂 +5 wos666 2026-04-03 5/250 2026-04-06 10:13 by 蓝云思雨
[考研] 296求调剂 +3 汪！？！ 2026-04-05 5/250 2026-04-05 17:38 by 蓝云思雨
[考研] 328分调剂 +6 门men 2026-04-04 6/300 2026-04-05 13:40 by imissbao
[考研] 一志愿江南大学085501机械工程专硕326分，本科佳木斯大学 +5 顾若浮生 2026-04-03 9/450 2026-04-05 09:57 by 1753564080
[考研] 11408 一志愿西电，277分求调剂 +4 zhouzhen654 2026-04-03 4/200 2026-04-04 18:10 by 猪会飞
[考研] 325求调剂 +4 春风不借意 2026-04-04 4/200 2026-04-04 14:46 by 湘农储能材料
[考研] 26调剂 086003 +6 失活的细胞 2026-04-04 6/300 2026-04-04 09:50 by zhangdingwa
[考研] 268求调剂 +8 你好tg 2026-04-03 9/450 2026-04-04 05:08 by gswylq
[考研] 372分材料与化工（085600）一志愿湖南大学求调剂 +3 蓝笺片 2026-04-03 4/200 2026-04-03 17:58 by Jimmyandyou
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭