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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 要表达的蛋白 基因序列扩出两个长度的正确片段 给跪了 求问各位大神
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syn1985

木虫 (正式写手)

[求助] 要表达的蛋白 基因序列扩出两个长度的正确片段 给跪了 求问各位大神 已有2人参与

小虫是做丝状真菌基因表达的，前一段时间做了个基因，用一对引物从mRNA中扩增出来了两个片段A和B，就全部连接到T载体上送去测序，本想着有一个肯定是错配，结果测序结果发现A和B都是目的片段，引物都可以比对上，只是A比B少剪切了一段序列，长度在200bp（在5‘端），我将这两段序列用软件翻译了一下，编码框不一样：A是+3 B是+1，两个编码的蛋白只在N端有20个AA不一样，其他都一样，用NCBI找了保守区也是相同的。
我现在不知道应该尝试表达哪一段序列，这两段不太一样的序列有说明了什么
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1楼 2014-10-04 14:36:14
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还重名啊

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
syn1985: 金币+1, 谢谢 2014-10-04 15:17:14
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-04 22:01:41
我做植物基因克隆也碰过类似情况，可能原因是 一个基因簇或者基因家族里的两个基因在DNA序列上串联排列，并且高度同源，所以你用一对引物，有概率把两个都克隆出来了，这种情况就是一个基因家族的两个成员。要么就是生物中基因复制现象，就是一个基因在基因组中发生复制扩张，那么两个就是一个基因。还有情况就是错配了。 你可以提高温度看看结果如何，然后把其他真菌中克隆的类似基因与之对比，看看通过保守结构域分析 能不能区别两者差异
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2楼2014-10-04 15:10:19
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 还重名啊 at 2014-10-04 15:10:19
我做植物基因克隆也碰过类似情况，可能原因是 一个基因簇或者基因家族里的两个基因在DNA序列上串联排列，并且高度同源，所以你用一对引物，有概率把两个都克隆出来了，这种情况就是一个基因家族的两个成员。要么就是 ...

我是直接从mRNA中扩出来的 这序列肯定是一段基因 只是他们在剪切内含子的时候出现了分歧 这个应该不会是你说的两个基因以及什么基因复制问题
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3楼2014-10-04 15:14:35
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
syn1985(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-04 22:02:07
如果两个片段都是+1开始的阅读框，那就可能是一个基因的两种剪接方式，要研究基因功能的话一般都是两个同时克隆。现在有一个片段从+3开始，那有可能是提RNA时有基因组DNA污染，PCR得到的片段有一个带内含子。你做的物种测序了没？可以拿基因组做个比对。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-10-04 15:49:56
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2014-10-04 15:49:56
如果两个片段都是+1开始的阅读框，那就可能是一个基因的两种剪接方式，要研究基因功能的话一般都是两个同时克隆。现在有一个片段从+3开始，那有可能是提RNA时有基因组DNA污染，PCR得到的片段有一个带内含子。你做的 ...

我用基因组作比较了，基因组序列比这两段序列都长很多，所以得到的长片段不会是基因组污染
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5楼2014-10-04 16:29:33
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2014-10-04 15:49:56
如果两个片段都是+1开始的阅读框，那就可能是一个基因的两种剪接方式，要研究基因功能的话一般都是两个同时克隆。现在有一个片段从+3开始，那有可能是提RNA时有基因组DNA污染，PCR得到的片段有一个带内含子。你做的 ...

CDS不可以从+3开始编码蛋白吗
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6楼2014-10-04 16:35:53
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
syn1985(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-04 22:02:31
syn1985: 金币+1, ★有帮助 2014-10-04 22:25:25
CDS是从起始密码子到终止密码子这段序列，其中不会包含多余的东西。不过mRNA会包含3`或5`-UTR，也有可能是引物不好，PCR时扩增了一部分非编码序列。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-10-04 18:41:34
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuderong at 2014-10-04 18:41:34
CDS是从起始密码子到终止密码子这段序列，其中不会包含多余的东西。不过mRNA会包含3`或5`-UTR，也有可能是引物不好，PCR时扩增了一部分非编码序列。

引物设计的没有问题 那两个基因在前40bp是完全相同的 所以我觉得应该是有一个内含子没有被剪切掉 这个我也查了一些文献 我就是不知道这个两个序列哪个有活性 或者我只能把两个序列都表达了
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8楼2014-10-04 22:24:53
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuderong at 2014-10-04 18:41:34
CDS是从起始密码子到终止密码子这段序列，其中不会包含多余的东西。不过mRNA会包含3`或5`-UTR，也有可能是引物不好，PCR时扩增了一部分非编码序列。

还有 CDS可能编码好几个蛋白 不一定里面只有一个 里面有很多种剪切机制的
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9楼2014-10-04 22:26:15
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syn1985

木虫 (正式写手)
怎么没人回复了
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10楼2014-10-06 11:21:25
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