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亚硝酸盐氧化还原酶基因nxrA怎么做PCR才能P出来啊？
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我今天刚做了亚硝酸盐氧化还原酶基因nxrA的PCR，采用的引物和PCR程序如下： 正向引物：nxrA-F 5’-CAGACCGACGTGTGCGAAAG-3’ 反向引物：nxrA-R 5’-TCYACAAGGAACGGAAGGTC-3’ PCR程序如下： 预变性 94℃ 5min，变性 94℃ 30s， 退火 53℃ 45s， 延伸 72℃ 45s， 40个循环，最终延伸 8min，求问PCR电泳为什么会出现如图所示？ 电泳图上出现的两条片段均不是目标片段。  pcr-nxrA.gif [ Last edited by 1949stone on 2013-7-22 at 16:37 ] |
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 核酸生物学实验经验 |
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-21 07:54:50
1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-22 16:38:17
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PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致 2013-7-20 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下： 一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。 二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。 三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因： 1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。 2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 四.考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。 调整变性和退火温度时间。 五.更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。 适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。 六.更换DNA聚合酶，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。 使用梯度降低PCR。 七.使用温度梯度PCR（楼主可能用不着）。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 八.适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。 九.调整变性和退火温度时间。 一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。 过去，我也回答过PCR非特异性扩增的问题，但是这次回答我在2013年7月20日重新编辑核对的。 |
4楼2013-07-20 14:54:10
凌波丽
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【答案】应助回帖
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myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。热心的小丽姐 2013-07-20 10:44:48
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PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 相关的问题，我最近就回答过，但是这次的回答最近做了补充和修改。 |
2楼2013-07-19 23:19:57
3楼2013-07-20 09:05:38
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5楼2013-07-20 14:55:33
1949stone: 可以多和凌波丽多交流啊 2013-07-22 16:38:55
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总之非常感谢。不过我们做PCR并不是非常专业。我们采用的PCR体系中试采用2*Taq PCR MIX，而不是分别加的酶、NTPs，同时由于我们的DNA样品中的微生物并不可知，我们希望从PCR能够证明这种功能基因是否存在，进一步拿出去进行qPCR测定。 因此，我们的研究通常是根据原有研究较好的Primer的基础上扩增，对于引物设计还是没有相应的研究。 能再麻烦问您一个问题吗？就是引物合成后是干粉状态，用什么来稀释比较好呢？TE buffer还是ddwater呢？ 非常感激您的细致和耐心的回答。 |
6楼2013-07-20 21:29:02
wangqi1107
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