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凌波丽

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-21 07:54:50
1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-22 16:38:17
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致
2013-7-20

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带,其原因与对策如下:
一.引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策:重新设计引物。
二.Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物;减低酶量或调换另一来源的酶;降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数。适当提高退火温度。
三.靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:
1.整个基因组或大片段的交叉污染,导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决:(1)在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。(2)除了酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。(3)所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。(4)重新提取模板DNA。
2.空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策:实验前对实验室充分通风,试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间,还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染,最基本的解决办法:重新提取模板DNA。
四.考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶,也可以用石蜡隔离模式。
调整变性和退火温度时间。
五.更换所有缓冲溶液,使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了,很不被重视。
适当调高复性温度。没有重新设计引物,不要大范围地变动反应体系的复性温度,要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增,则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度;如果出现任何扩增带,则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
六.更换DNA聚合酶,酶量不要太大,以免出现特异性扩增。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
使用梯度降低PCR。
七.使用温度梯度PCR(楼主可能用不着)。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,非特异性扩增较多,这时,最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环,退火温度降低1-2度,直至到达正常的Tm附近的退火温度。
八.适当减低的dNTP的浓度,可以分梯度进行。
九.调整变性和退火温度时间。

   一般的调整顺序(不是绝对的):若PCR反应后无任何产物,可先调整Mg2+ 浓度,Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L,不低于1.0mmol/L,调整时从低往高分梯度加,每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度,在调整引物与模板的结合温度,调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时,把酶换成其他类型的DNA聚合酶(高保真酶或者热启动酶)。再往后,检测和重新提取DNA模板(包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短,清除酚和SDS,检测模板浓度,必要时要对DNA模板测序)。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效,那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度,最后重新设计引物,其他顺序可变。
    过去,我也回答过PCR非特异性扩增的问题,但是这次回答我在2013年7月20日重新编辑核对的。
4楼2013-07-20 14:54:10
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