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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 形态解剖 » ：【植物】+【求助】+幼嫩材料植物茎、根石蜡切片制法~
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张豆豆！！

新虫 (初入文坛)

[求助] ：【植物】+【求助】+幼嫩材料植物茎、根石蜡切片制法~ 已有5人参与

我对3个月的实生苗柽柳的茎和根做石蜡切片~做了很久很久都没有做出来····很苦恼····不知道是不是因为幼嫩植物水分太多？切出来的片子质量很不高~破碎化很严重~请各位高手多多指教~
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1楼 2014-09-15 22:30:23
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银绳

木虫 (著名写手)

植物菜鸟

【答案】应助回帖

★
张豆豆！！(q317476148代发): 金币+1, 鼓励积极应助 2015-05-19 09:25:18
我想知道你切出来的片子是什么样子的？如果切出来的片子效果可以，后面的操作就没有问题。
先推荐你看一本书吧，叫《植物显微技术》，非常好的一本书，你可以参照试试。
1、刀片不好，会把片子损坏。刀片不锋利，很容易使切片变得粗糙不完整，有划痕等。
2、浸蜡包埋不彻底，很容易就破碎。因为是根茎类药材，浸蜡可能不容易透彻，切片时就会破碎。你可以延长浸蜡时间试试。

一点小经验，希望可以帮到你。
立马把那本书买了，石蜡切片根本不是问题。
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爱好植物，但是是一只菜鸟！
4楼2015-01-27 14:43:40
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q317476148

铁杆木虫 (著名写手)

喵星人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张豆豆！！: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-10-01 18:55:37
把方法帖出来看看，  切片破碎率很高的话，影响因素有很多，比如脱水不彻底，透明不彻底，刀片质量不好。
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2楼2014-09-16 22:54:50
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张豆豆！！

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by q317476148 at 2014-09-16 22:54:50
把方法帖出来看看，  切片破碎率很高的话，影响因素有很多，比如脱水不彻底，透明不彻底，刀片质量不好。

出野外，不好意思才看到，实验步骤
1.        取材   固定 ：用FAA 固定液
2.        冲洗 ：50%酒精
3.        Day1: 50%酒精（30min）→50%酒精(20min)（2）20min→番红（过夜）
4.        Day2：脱水 ：70%（1h或长时间保存）→80%（1h）→95%（1h）→100%  （1h）→100%（45min）。
5.        番红染色和透明 ：材料分别加入1/2纯酒精1/2纯二甲苯番红饱和溶液(1h)→纯二甲苯（1 h）→纯二甲苯（45min）。
6． 浸蜡：
        （1）1/2 二甲苯+ 1/2 石蜡(过夜，40 ℃)。50℃缓冲
Day3：
        （2）纯石蜡               （1 h） 56℃
        （3）纯石蜡               （1 h） 57℃
        （4）纯石蜡               （1 h） 58℃
7．        包埋： 8.切片：  
9． 粘片：在载玻片上滴一滴明胶，置40~50度温水中展平，放在烘箱中（40℃）5小时以上。  切片在45℃ 恒温箱中烘干3～ 4h, 即可进行脱蜡等步骤。
Day4：
10．脱蜡：经烘干后的切片入二甲苯（30min）→二甲苯（30min）→1/2 二甲苯十1/2纯酒精（5min）→100%酒精（5min）→95％酒精（5min）→80%（5min）→70%（5min）。   （二甲苯步骤以玻片干净为基准）
染色：番红染液染色1小时
脱水：70%（1min）→80%（1min）→固绿（1-5s）→95%（1min）→100%  （1min）→100%（1min）
透明：1/2 二甲苯十1/2纯酒精（5min）→二甲苯（5min）→二甲苯（2min）
中性树胶封片后镜检。
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3楼2014-10-01 18:57:19
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★
q317476148: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励积极应助 2015-05-19 09:25:05
转载自{zham0001 }
一 材料的选择与分割
　　选取新鲜、无病虫害并具代表性的材料
　　先作徒手切片或剥离检查，决定适宜的材料，立即固定。
　　注意按季节和植物生长发育不同阶段取材。
　　材料大小要适当；
　　　　例根：直径5mm以内----切取5-10mm小段
　　　　例叶：切成2-5mm
　　　　例茎：横切或纵切
　　　　例花：花药:横纵；子房：横纵
二 杀死、固定、保存
　　杀死：在制片过程中，将制片的材料迅速杀死，使组织块尽量保持原生活状态。这种处理叫杀生（死）。用一种或多种化学药品。
　　固定：在杀生处理过程中，将材料按原来的形态保存下来，并为后续制片保持固有形态，达到固定的要求。杀生、固定关系密切，通常二者兼有作用。
　　保存：组织块茎杀伤固定后，能较长时间保存下来，仍能制片。
常用固定液：
　　FAA固定液（福尔马林-冰醋酸-酒精），万能固定液或标准保存液。
　　适用范围：根、茎、叶、花药、子房的组织切片均可
　　固定时间：一般24h， 并可在此液中长期保存。温度宜低（10度左右）
　　之后不必水洗，直接70%（嫩材料50%）酒精洗---进行脱水。
　　配法：福尔马林（38%甲醛）----5ml
　　　　　冰醋酸-------------------------5ml
　　　　　70%酒精-----------------------90ml （幼嫩材料50% 酒精防材料收缩）
　　用于胚胎材料改为：50% 酒精----89ml
　　　　　　　　　　　甲醛------------5ml
　　　　　　　　　　　冰醋酸---------6ml
　　　　*可加入5ml甘油（丙三醇）放固定液蒸发和材料变硬。
Canoys Fluid（卡诺氏液）
　　适用范围：常用于细胞学如根尖，花药的压片，及子房石蜡切片
　　固定时间：不同。根尖、花药15min-半小时，花药1h，其他材料不超过24小时（12-24h）否则材料受到破坏。固定后用同浓度酒精洗涤。
　　保存液：70% 酒精（95%，85% 酒精浸洗约20 分---70%酒精中保存）
　　卡诺液配制：纯酒精（或95%酒精）：冰醋酸=3：1
三 脱水
　　制作石蜡切片，要把材料包埋在石蜡中，所以浸蜡前必须把材料中水分出去。有水分石蜡无法渗入到细胞中。
　　脱水：就是用一种药剂，把材料中水分全部代替干净。
其作用：
　　1 材料变硬，形状更稳定。
　　2 除尽水分，使包埋剂和封固剂渗透于组织中，包埋剂和封固剂不能与水混合，必须
把水除尽。
常用脱水剂：
　　酒精（不是最理想的，易引起组织收缩，使材料变硬。脱水后还要用其他有机溶剂除尽酒精。但应用久，价格低廉。）
注意：
　　1 脱水从低浓度开始逐渐替换高浓度酒精。否则发生细胞收缩。
　　2 从同浓度（保存液中）酒精开始。例FAA 从70% （50%）酒精开始。
　　3 30%---50%---70%----85%----95%（加少许番红，便于包埋中识别）---100%--100%。加盖，各级酒精停留时间因材料而定，材料2mm，各2-4h。
四 透明
　　脱水后要经过常用的有机溶剂（氯仿，二甲苯等）进行透明，便于石蜡及封固胶进入和溶合。当材料为透明剂所占，在显微镜下观察成透明状态。
　　常用的透明剂：二甲苯、氯仿、冬青油等。
　　二甲苯（xylol）是目前应用最广的透明剂，作用迅速，但易使材料变脆。盖盖！！
　　注意：使用时材料必脱尽水分，否则发生乳状混浊。
　　　　　避免材料收缩----1/2 xyl + 1/2 alc （1h）-----xyl （1h）-----xyl （0.5 h）
五 浸蜡
　　以石蜡透入细胞组织内的全过程称为---浸蜡。其目的在于，除去材料中的二甲苯而代之以石蜡。
方法：
　　1 透明材料放小烧杯中，注新二甲苯漫过材料
　　2 加溶化的石蜡，由烧杯一侧慢慢倒入，与二甲苯等量
　　3 小烧杯放入蜡箱内（60℃）30-60min
　　4 换纯蜡，每次1-2h
六 包埋
　　选蜡：软材料---------------------------54-56℃熔点，（黄承芬p73）
　　　　　5um以下厚度或夏季切片---58-60℃石蜡
　　叠纸盒
　　倒干净溶解的石蜡,半盒。
　　把材料放入，排列好，切面朝下（注意横切纵切）
　　赶气泡，放冷水中冷却。
七．切片
八．粘片和展片。
九．脱蜡：二甲苯
十．染色：苏木精、番红、固绿、碱性品红
　　单染 ：只用一种染料
　　双重染色：两种染料 番红--固绿； 苏木精---曙红
　　多重染色：多种染料 番红—固绿—桔红G；酸性品红—苯胺蓝—桔红G等
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
5楼2015-01-28 22:26:57
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