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：【植物】+【求助】+幼嫩材料植物茎、根石蜡切片制法~ 已有5人参与
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我对3个月的实生苗柽柳的茎和根做石蜡切片~做了很久很久都没有做出来····很苦恼····不知道是不是因为幼嫩植物水分太多？切出来的片子质量很不高~破碎化很严重~请各位高手多多指教~ |
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出野外，不好意思才看到，实验步骤 1. 取材 固定 ：用FAA 固定液 2. 冲洗 ：50%酒精 3. Day1: 50%酒精（30min）→50%酒精(20min)（2）20min→番红（过夜） 4. Day2：脱水 ：70%（1h或长时间保存）→80%（1h）→95%（1h）→100% （1h）→100%（45min）。 5. 番红染色和透明 ：材料分别加入1/2纯酒精1/2纯二甲苯番红饱和溶液(1h)→纯二甲苯（1 h）→纯二甲苯（45min）。 6． 浸蜡： （1）1/2 二甲苯+ 1/2 石蜡(过夜，40 ℃)。50℃缓冲 Day3： （2）纯石蜡 （1 h） 56℃ （3）纯石蜡 （1 h） 57℃ （4）纯石蜡 （1 h） 58℃ 7． 包埋： 8.切片： 9． 粘片：在载玻片上滴一滴明胶，置40~50度温水中展平，放在烘箱中（40℃）5小时以上。 切片在45℃ 恒温箱中烘干3～ 4h, 即可进行脱蜡等步骤。 Day4： 10．脱蜡：经烘干后的切片入二甲苯（30min）→二甲苯（30min）→1/2 二甲苯十1/2纯酒精（5min）→100%酒精（5min）→95％酒精（5min）→80%（5min）→70%（5min）。 （二甲苯步骤以玻片干净为基准） 染色：番红染液染色1小时 脱水：70%（1min）→80%（1min）→固绿（1-5s）→95%（1min）→100% （1min）→100%（1min） 透明：1/2 二甲苯十1/2纯酒精（5min）→二甲苯（5min）→二甲苯（2min） 中性树胶封片后镜检。 |
3楼2014-10-01 18:57:19
q317476148
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2楼2014-09-16 22:54:50
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4楼2015-01-27 14:43:40
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【答案】应助回帖
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q317476148: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励积极应助 2015-05-19 09:25:05
q317476148: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励积极应助 2015-05-19 09:25:05
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转载自{zham0001 } 一 材料的选择与分割 选取新鲜、无病虫害并具代表性的材料 先作徒手切片或剥离检查，决定适宜的材料，立即固定。 注意按季节和植物生长发育不同阶段取材。 材料大小要适当； 例根：直径5mm以内----切取5-10mm小段 例叶：切成2-5mm 例茎：横切或纵切 例花：花药:横纵；子房：横纵 二 杀死、固定、保存 杀死：在制片过程中，将制片的材料迅速杀死，使组织块尽量保持原生活状态。这种处理叫杀生（死）。用一种或多种化学药品。 固定：在杀生处理过程中，将材料按原来的形态保存下来，并为后续制片保持固有形态，达到固定的要求。杀生、固定关系密切，通常二者兼有作用。 保存：组织块茎杀伤固定后，能较长时间保存下来，仍能制片。 常用固定液： FAA固定液（福尔马林-冰醋酸-酒精），万能固定液或标准保存液。 适用范围：根、茎、叶、花药、子房的组织切片均可 固定时间：一般24h， 并可在此液中长期保存。温度宜低（10度左右） 之后不必水洗，直接70%（嫩材料50%）酒精洗---进行脱水。 配法：福尔马林（38%甲醛）----5ml 冰醋酸-------------------------5ml 70%酒精-----------------------90ml （幼嫩材料50% 酒精防材料收缩） 用于胚胎材料改为：50% 酒精----89ml 甲醛------------5ml 冰醋酸---------6ml *可加入5ml甘油（丙三醇）放固定液蒸发和材料变硬。 Canoys Fluid（卡诺氏液） 适用范围：常用于细胞学如根尖，花药的压片，及子房石蜡切片 固定时间：不同。根尖、花药15min-半小时，花药1h，其他材料不超过24小时（12-24h）否则材料受到破坏。固定后用同浓度酒精洗涤。 保存液：70% 酒精（95%，85% 酒精浸洗约20 分---70%酒精中保存） 卡诺液配制：纯酒精（或95%酒精）：冰醋酸=3：1 三 脱水 制作石蜡切片，要把材料包埋在石蜡中，所以浸蜡前必须把材料中水分出去。有水分石蜡无法渗入到细胞中。 脱水：就是用一种药剂，把材料中水分全部代替干净。 其作用： 1 材料变硬，形状更稳定。 2 除尽水分，使包埋剂和封固剂渗透于组织中，包埋剂和封固剂不能与水混合，必须 把水除尽。 常用脱水剂： 酒精（不是最理想的，易引起组织收缩，使材料变硬。脱水后还要用其他有机溶剂除尽酒精。但应用久，价格低廉。） 注意： 1 脱水从低浓度开始逐渐替换高浓度酒精。否则发生细胞收缩。 2 从同浓度（保存液中）酒精开始。例FAA 从70% （50%）酒精开始。 3 30%---50%---70%----85%----95%（加少许番红，便于包埋中识别）---100%--100%。加盖，各级酒精停留时间因材料而定，材料2mm，各2-4h。 四 透明 脱水后要经过常用的有机溶剂（氯仿，二甲苯等）进行透明，便于石蜡及封固胶进入和溶合。当材料为透明剂所占，在显微镜下观察成透明状态。 常用的透明剂：二甲苯、氯仿、冬青油等。 二甲苯（xylol）是目前应用最广的透明剂，作用迅速，但易使材料变脆。盖盖！！ 注意：使用时材料必脱尽水分，否则发生乳状混浊。 避免材料收缩----1/2 xyl + 1/2 alc （1h）-----xyl （1h）-----xyl （0.5 h） 五 浸蜡 以石蜡透入细胞组织内的全过程称为---浸蜡。其目的在于，除去材料中的二甲苯而代之以石蜡。 方法： 1 透明材料放小烧杯中，注新二甲苯漫过材料 2 加溶化的石蜡，由烧杯一侧慢慢倒入，与二甲苯等量 3 小烧杯放入蜡箱内（60℃）30-60min 4 换纯蜡，每次1-2h 六 包埋 选蜡：软材料---------------------------54-56℃熔点，（黄承芬p73） 5um以下厚度或夏季切片---58-60℃石蜡 叠纸盒 倒干净溶解的石蜡,半盒。 把材料放入，排列好，切面朝下（注意横切纵切） 赶气泡，放冷水中冷却。 七．切片 八．粘片和展片。 九．脱蜡：二甲苯 十．染色：苏木精、番红、固绿、碱性品红 单染 ：只用一种染料 双重染色：两种染料 番红--固绿； 苏木精---曙红 多重染色：多种染料 番红—固绿—桔红G；酸性品红—苯胺蓝—桔红G等 |
5楼2015-01-28 22:26:57
