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aini_1314

新虫 (初入文坛)

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虫号: 2102327
注册: 2012-11-02
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 请教几个和Protein Thermal Shift( ThermoFluor)有关的问题，有对RT-PCR了解的也可以已有2人参与

背景简介（做过的可以略过）：
Protein Thermal Shift（ ThermoFluor），就是测蛋白质热转变稳定性的一种技术，属于RT-PCR技术的一种衍生用法。可以高通量的对蛋白进行筛选，蛋白与配体的相互作用等。具体信息可以参见wiki百科。http://en.wikipedia.org/wiki/Thermal_Shift_Assay
A thermal shift assay, also called Differential Scanning Fluorimetry (DSF) is a thermal-denaturation assay that measures the thermal stability of a target protein and a subsequent increase in protein melting temperature upon binding of a ligand to the protein.
Life公司也推出了相关的产品：
http://www.lifetechnologies.com/ ... -thermal-shift.html
具体原理可以简单的理解为，蛋白有疏水区结构，隐藏在内部，在温度上升时，蛋白的结构会被打开，暴露出疏水区，荧光染料Sypro Orange就可以与该区域进行结合，并被激发荧光。在有配体（小分子）结合的情况下，蛋白稳定性会上升，表现为熔解温度的上升（>4℃）。
实验过程：
本实验中使用的是Bio-rad 公司的RT-PCR仪，利用CFX Manager（Data Analysis）生成的数据如图所示：

左图为蛋白熔解曲线，右图为对温度求导曲线（负值）。
在实验中设置了对照组，即图中红色线，加入配体（小分子）后的实验曲线为绿色线。
问题1，为何实验组的熔解曲线峰值偏低？
问题2，从该熔解曲线看，是否可以认为蛋白与小分子有相互作用？
问题3（略业余），Bio-rad公司给出的分析程序为何要将导数曲线取负值？
问题4，在类似的有荧光的反应中，如果反应体系中出现沉淀，是否会造成荧光值的剧烈变化？（数量级的变化）

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