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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 请教几个和Protein Thermal Shift( ThermoFluor)有关的问题，有对RT-PCR了解的也可以
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aini_1314

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教几个和Protein Thermal Shift( ThermoFluor)有关的问题，有对RT-PCR了解的也可以 已有2人参与

背景简介（做过的可以略过）：
Protein Thermal Shift（ ThermoFluor），就是测蛋白质热转变稳定性的一种技术，属于RT-PCR技术的一种衍生用法。可以高通量的对蛋白进行筛选，蛋白与配体的相互作用等。具体信息可以参见wiki百科。http://en.wikipedia.org/wiki/Thermal_Shift_Assay
A thermal shift assay, also called Differential Scanning Fluorimetry (DSF) is a thermal-denaturation assay that measures the thermal stability of a target protein and a subsequent increase in protein melting temperature upon binding of a ligand to the protein.
Life公司也推出了相关的产品：
http://www.lifetechnologies.com/ ... -thermal-shift.html
具体原理可以简单的理解为，蛋白有疏水区结构，隐藏在内部，在温度上升时，蛋白的结构会被打开，暴露出疏水区，荧光染料Sypro Orange就可以与该区域进行结合，并被激发荧光。在有配体（小分子）结合的情况下，蛋白稳定性会上升，表现为熔解温度的上升（>4℃）。
实验过程：
本实验中使用的是Bio-rad 公司的RT-PCR仪，利用CFX Manager（Data Analysis）生成的数据如图所示：
请教几个和Protein Thermal Shift( ThermoFluor)有关的问题，有对RT-PCR了解的也可以
左图为蛋白熔解曲线，右图为对温度求导曲线（负值）。
在实验中设置了对照组，即图中红色线，加入配体（小分子）后的实验曲线为绿色线。
问题1，为何实验组的熔解曲线峰值偏低？
问题2，从该熔解曲线看，是否可以认为蛋白与小分子有相互作用？
问题3（略业余），Bio-rad公司给出的分析程序为何要将导数曲线取负值？
问题4，在类似的有荧光的反应中，如果反应体系中出现沉淀，是否会造成荧光值的剧烈变化？（数量级的变化）
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1楼 2014-09-03 20:58:23
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ltxg123

新虫 (初入文坛)
你好，新手，想请教一下，做蛋白热漂移实验拿到数据之后应该怎么进行分析呢？
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3楼2019-11-22 18:29:24
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普鲁旺斯花季

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，你好，我最近也在做这个实验。用的是BioSystems的PCR仪，做出的结果问题很大，主要是不知道选择哪一种reporter ，之前做的时候选的是ROX，其他还有 SYBR green，FAM等。想问你是具体怎么做的
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一生转而得一夏，当司掌好年华
2楼2017-08-21 12:01:02
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陈陈陈梦

新虫 (初入文坛)
我也是新手，联系方式微信：mm05090509，希望有人一起交流

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4楼2020-12-07 15:19:15
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陈陈陈梦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ltxg123 at 2019-11-22 18:29:24
你好，新手，想请教一下，做蛋白热漂移实验拿到数据之后应该怎么进行分析呢？

你好，你会分析了吗

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5楼2020-12-07 15:19:41
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