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草帽小子

银虫 (小有名气)

[求助] 请问我分别合成了两条基本完全互补的单链,如何将他们合为双链呢? 已有2人参与

请问我分别合成了两条基本完全互补的单链,如何将他们合为双链呢?网上说直接用TE或者水溶,两条单链等摩尔量混匀,PCR 95℃ 3 min,直接关机,让机器自然缓慢降温,来杂交退火。请问体系里面需不需要加酶呢?合成的双链是用来连接用的,有什么的注意事项吗?
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
草帽小子: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2014-08-26 09:02:21
等摩尔混合,可以用水也可以用PCR的缓冲液。不用加酶。退火要慢,链越短越要慢。最好是能用PCR仪慢慢退火,就是做成很多个循环,每个循环降一点,最后到室温。做连接的话,不知道你的具体情况,不好说。不过由于这种链很短,摩尔数很大的,不要加多了。
2楼2014-08-25 12:19:46
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
草帽小子(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-25 22:48:34
草帽小子: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-08-26 09:02:36
就是做一个巢式PCR,缓慢退火,72度延伸20秒左右。不需要加酶,P完后最好先连接到T载体上,然后双酶切,再连接到表达载体上面!
3楼2014-08-25 12:52:40
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4楼2021-08-05 15:24:25
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