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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切求助
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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切求助 已有3人参与

目的条带大小应为3447bp，使用kpn1和sal1两种限制性内切酶，菌液PCR如图1，选取1、2、3、5继续试验，扩大培养后双酶切电泳检测如图2，酶切时间3小时后又在4度冰箱里放置了一个多小时；图3也是双酶切图，酶切时间两个半小时，感觉有些符合要求，但是由于使用的胶板上排梳子之前用过，有些重叠，所以用剩余样品重新跑了胶，此时样品酶切了两个半小时后在4度冰箱里放了一个小时左右，再次电泳检测结果和如图2一样。（所以载体为Pmd19，大小2692bp）求高手解释一下原因，为什么会出现这样的结果？？非常感谢！

双酶切求助
图1


双酶切求助-1
图2


双酶切求助-2
图3
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1楼 2014-08-25 11:09:32
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gongzifan812

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-20 21:18:34
个人愚见：
1.什么牌子的酶，NEB一般一小时足够了，切三个小时有时候会出现奇怪的片段
2.有的时候没切开的载体不是线状的DNA，不同的构象会导致跑出来的条带不一样，supercoil的DNA普遍比较慢

若有不合理的希望指教
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7楼2014-08-27 22:26:52
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-20 21:18:24
为什么酶切完了要在4度放一个小时呢？这里面是什么原理啊

你最后问为什么是这样的结果，这结果不一样吗？不是酶切第一次和第三次都是跑出来的图2吗？
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2楼2014-08-25 11:21:52
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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-25 11:21:52
为什么酶切完了要在4度放一个小时呢？这里面是什么原理啊

你最后问为什么是这样的结果，这结果不一样吗？不是酶切第一次和第三次都是跑出来的图2吗？

图2 不是我们要的结果呀，正常应该切出两条带，一条3500左右，一条2700左右不是？放4度是因为所有胶板都被人用了，所以只能等着
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3楼2014-08-25 12:07:20
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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-25 14:34:26
哦哦   这种情况下，如果你的酶切位点分析正确的话。那么就是你的载体片段有问题了。
看图上分析，你的载体3000+，可能对，片段大小不对。
你自己确定一下自己载体、片段是不是已经完全切开了再回收的。...

额，应该是3000+的可能是目的片段，但是载体没有切到想要的大小，，而且第一号管还有一条比5000大的，
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5楼2014-08-25 14:58:44
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