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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切求助 已有3人参与

目的条带大小应为3447bp,使用kpn1和sal1两种限制性内切酶,菌液PCR如图1,选取1、2、3、5继续试验,扩大培养后双酶切电泳检测如图2,酶切时间3小时后又在4度冰箱里放置了一个多小时;图3也是双酶切图,酶切时间两个半小时,感觉有些符合要求,但是由于使用的胶板上排梳子之前用过,有些重叠,所以用剩余样品重新跑了胶,此时样品酶切了两个半小时后在4度冰箱里放了一个小时左右,再次电泳检测结果和如图2一样。(所以载体为Pmd19,大小2692bp)求高手解释一下原因,为什么会出现这样的结果??非常感谢!

双酶切求助
图1


双酶切求助-1
图2


双酶切求助-2
图3
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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-25 11:21:52
为什么酶切完了要在4度放一个小时呢?这里面是什么原理啊

你最后问为什么是这样的结果,这结果不一样吗?不是酶切第一次和第三次都是跑出来的图2吗?

图2 不是我们要的结果呀,正常应该切出两条带,一条3500左右,一条2700左右不是?放4度是因为所有胶板都被人用了,所以只能等着
3楼2014-08-25 12:07:20
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-20 21:18:24
为什么酶切完了要在4度放一个小时呢?这里面是什么原理啊

你最后问为什么是这样的结果,这结果不一样吗?不是酶切第一次和第三次都是跑出来的图2吗?
2楼2014-08-25 11:21:52
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漂流瓶1991

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-25 14:34:26
哦哦   这种情况下,如果你的酶切位点分析正确的话。那么就是你的载体片段有问题了。
看图上分析,你的载体3000+,可能对,片段大小不对。
你自己确定一下自己载体、片段是不是已经完全切开了再回收的。...

额,应该是3000+的可能是目的片段,但是载体没有切到想要的大小,,而且第一号管还有一条比5000大的,
5楼2014-08-25 14:58:44
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lsm115566

木虫 (正式写手)

检查一下操作步骤细节

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
学无止境
6楼2014-08-26 20:22:21
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