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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 恳求各位大神支招，我快崩溃了！！！
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prominetsun

金虫 (正式写手)

[求助] 恳求各位大神支招，我快崩溃了！！！ 已有7人参与

各位虫友们，我是即将研二的新手，刚开始跟师兄做实验的时候，一切很顺利，PCR条带也很清晰，但是！过了一个月放假回来就不行了！怎么P都P不出来！！marker有条带，其余什么都没有了，样品就跟没添加过一样，放在紫外成像仪中什么都没有啊！！！为此我还做过对比试验，就是加新酶再做一遍，加新的dNTP再做一遍，但是都于事无补！！除了marker有条带什么都没有！！！现在实验处于停滞状态了，根本进行不下去。。。快哭了但是都不知道什么原因。。。照了其他实验室的PCR仪也没做出来。。。请问各位虫友有没有遇到过类似情况？非常希望大家能指点迷津！不然我就该急死了。。。
关于PCR:
我做的是 Pfu 酶的，片段长度在1.5 kb 左右，延伸时间一分半钟，流程为95°C解链，55℃退火，75℃延伸，无论配50u还是25u体系都没法P出来。。注意：我以前是可以P出来的。。。哭。。
各位大神，我最近两个月都浪费在上面了，无任何头绪，求各位的意见！要不就该被逼疯了。。。。。呜。。。。。呜。。。。
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1楼 2014-08-17 09:50:58
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:48:39
1，先拿你们实验室已有的，一定能够扩增出来的引物，进行一次PCR,目的是确定酶的反应体系没问题，而且你个人的技术没问题
2，如果以上没问题呢，开始扩增你自己的目的片段：可以适当增加引物的用量（2倍或4倍），试试，
（模板就用1中你用过的模板）
祝好运!
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11楼2014-08-17 20:12:24
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普通回帖

小松果2012

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
考虑引物吧，我师妹也正遇到这个问题呢。
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2楼2014-08-17 10:27:03
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prominetsun

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小松果2012 at 2014-08-17 10:27:03
考虑引物吧，我师妹也正遇到这个问题呢。

难道所有引物都不行了？我最后验证还专门找了个之前好P的片段，跟我的引物是不同的。而且我的引物7月份刚到，现在就出问题了？。。。。。

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3楼2014-08-17 10:30:49
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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prominetsun(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:36:59
可能是引物出现了问题，重新合成引物试试，或者是模板有问题~~~
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4楼2014-08-17 11:15:25
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prominetsun

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-08-17 11:15:25
可能是引物出现了问题，重新合成引物试试，或者是模板有问题~~~

模板也是换了个之前不同的模板还是做不出来。。。。引物重新合成。。。？啊，那岂不是又要花钱请人做引物了。。。。

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5楼2014-08-17 11:24:06
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by prominetsun at 2014-08-17 11:24:06
模板也是换了个之前不同的模板还是做不出来。。。。引物重新合成。。。？啊，那岂不是又要花钱请人做引物了。。。。
...

是啊，那没有办法啊，引物合成也不是很贵吧~~~只能换引物试试了！
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6楼2014-08-17 11:46:18
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梦梦神

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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prominetsun(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:37:10
我的最近也是P着P着啥也没了，模板也换的新的还是不行，正在合成新引物。
建议你重新买引物，真的不算贵，回来注意分装好，以后如果还是突然P不出来可以换你分装的另外一管试。
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7楼2014-08-17 11:55:18
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
果断换酶，你的pfu酶出问题了，有些不稳定，建议换酶，然后做个阳性对照

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8楼2014-08-17 13:54:53
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prominetsun

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-17 13:54:53
果断换酶，你的pfu酶出问题了，有些不稳定，建议换酶，然后做个阳性对照

换了新的pfu酶也是这样。。。。师兄做他的实验时倒是P出来了，但是条带很浅。。。也是用pfu酶。。求问这是怎么回事？
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9楼2014-08-17 14:54:33
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
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prominetsun(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:37:26
已经稀释好的引物在4℃存放时间最好在一个月之内，时间久了可能就会扩增效率降低，你可以先重新合成一下引物，很便宜的。模板也有可能出问题的，不过我感觉若没有引物二聚体的条带的话可能是引物的问题，我前段时间也遇到过类似的问题，换过引物以后就好了！祝顺利！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
10楼2014-08-17 15:06:47
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