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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 恳求各位大神支招，我快崩溃了！！！
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prominetsun

金虫 (正式写手)

[求助] 恳求各位大神支招，我快崩溃了！！！已有7人参与

各位虫友们，我是即将研二的新手，刚开始跟师兄做实验的时候，一切很顺利，PCR条带也很清晰，但是！过了一个月放假回来就不行了！怎么P都P不出来！！marker有条带，其余什么都没有了，样品就跟没添加过一样，放在紫外成像仪中什么都没有啊！！！为此我还做过对比试验，就是加新酶再做一遍，加新的dNTP再做一遍，但是都于事无补！！除了marker有条带什么都没有！！！现在实验处于停滞状态了，根本进行不下去。。。快哭了但是都不知道什么原因。。。照了其他实验室的PCR仪也没做出来。。。请问各位虫友有没有遇到过类似情况？非常希望大家能指点迷津！不然我就该急死了。。。
关于PCR:
我做的是 Pfu 酶的，片段长度在1.5 kb 左右，延伸时间一分半钟，流程为95°C解链，55℃退火，75℃延伸，无论配50u还是25u体系都没法P出来。。注意：我以前是可以P出来的。。。哭。。
各位大神，我最近两个月都浪费在上面了，无任何头绪，求各位的意见！要不就该被逼疯了。。。。。呜。。。。。呜。。。。
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1楼2014-08-17 09:50:58
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prominetsun

金虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by 小松果2012 at 2014-08-17 10:27:03
考虑引物吧，我师妹也正遇到这个问题呢。

难道所有引物都不行了？我最后验证还专门找了个之前好P的片段，跟我的引物是不同的。而且我的引物7月份刚到，现在就出问题了？。。。。。

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3楼2014-08-17 10:30:49
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prominetsun

金虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-08-17 11:15:25
可能是引物出现了问题，重新合成引物试试，或者是模板有问题~~~

模板也是换了个之前不同的模板还是做不出来。。。。引物重新合成。。。？啊，那岂不是又要花钱请人做引物了。。。。

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5楼2014-08-17 11:24:06
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金虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-17 13:54:53
果断换酶，你的pfu酶出问题了，有些不稳定，建议换酶，然后做个阳性对照

换了新的pfu酶也是这样。。。。师兄做他的实验时倒是P出来了，但是条带很浅。。。也是用pfu酶。。求问这是怎么回事？
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9楼2014-08-17 14:54:33
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金虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by trizol11 at 2014-08-18 15:15:05
你的模板换一下，
还有就是你的循环数是多少，我建议用热启动法跑一次PCR

35～个循环，模板换过不管用，热启动做过了一样。。。。

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16楼2014-08-18 15:36:45
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14楼: Originally posted by vapordw at 2014-08-18 14:59:57
有么有考虑是PCR仪出问题了- - 整个实验室其他人P的结果都好好的么？
如果不是仪器问题，可能就是引物出问题了吧- -也许放假的时候停电，然后 一个冰箱里的东西都化了了了了啦了

一个师兄P出来了但是条带较浅。。。我们实验室两台我都没P出来。。。去其他实验室做也没有。。。

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17楼2014-08-18 15:38:10
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金虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by 凤丫头1988 at 2014-08-19 21:49:00
引物合成不都是2OD的吗？另一管干粉呢？你先换个Taq酶扩扩看，Taq酶好扩一些（Taq酶便宜）。再或者扩个梯度，尝试不同的退火温度，水最好也分装之后用。是提的什么的DNA做模板啊？模板跑胶正常吗？

师兄只给了一管。。。DNA是酵母全基因组，基因组并没有跑胶。。。求问全基因组也可以跑胶的吗？不是没什么意义么。。。正常的话条带是什么样的？退火温度之前这个温度是能P出来的。。不知为什么现在就做不出来了。。。

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19楼2014-08-19 22:12:29
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金虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by 小松果2012 at 2014-08-17 10:27:03
考虑引物吧，我师妹也正遇到这个问题呢。

实验已做出来了，就是引物问题。太感谢啦！！！你的师妹解决了不？
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23楼2014-08-22 14:17:07
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金虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-08-17 11:15:25
可能是引物出现了问题，重新合成引物试试，或者是模板有问题~~~

啊啊啊！！！爱死你啦！！！就是引物的问题，我之前还怀疑酶啊，还有dNTP什么的，到最后还是引物！！！
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24楼2014-08-22 14:18:08
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金虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 梦梦神 at 2014-08-17 11:55:18
我的最近也是P着P着啥也没了，模板也换的新的还是不行，正在合成新引物。
建议你重新买引物，真的不算贵，回来注意分装好，以后如果还是突然P不出来可以换你分装的另外一管试。

我已经做出来啦！超级哈皮！！不知你的怎么样啦？
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25楼2014-08-22 14:18:45
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