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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有8人参与

各位虫友,最近构建载体出现一个问题:5.8kb左右的双酶切载体连接1.5kb左右的双酶切pcr产物,涂平板后长了几个菌落,当时心情那个激动啊无法言说!之后做了个菌体电泳,心瞬间冻到了冰点:菌体电泳条带显示几个菌落的电泳条带居然比原始载体(原初质粒没有进行酶切的)的要跑得快!!
其中1,2是原始质粒 3,4,5,6是抗性平板上长出菌落的菌体电泳图,为什么会是这种结果呢?载体构建
M3_P]RP{WZO]XGHN64]3F$K.jpg
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Hliotrope

木虫 (著名写手)

菌体电泳?什么是菌体电泳?上样口真亮啊。。。
Someone
2楼2014-08-12 10:27:17
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lhxbio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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jiaoxiayoulu(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-15 12:56:26
真牛!什么叫菌体电泳?正常程序应该是菌落PCR初步鉴定,然后提质粒酶切,条带大小正确,再送测序。
3楼2014-08-12 10:31:51
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
质粒载体双酶切前是多大?怎么都没有Marker呢?
4楼2014-08-12 10:33:37
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

还有  你这个菌体电泳是质粒粗提么?
5楼2014-08-12 10:34:50
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Hliotrope at 2014-08-12 10:27:17
菌体电泳?什么是菌体电泳?上样口真亮啊。。。

将菌液用质粒提取试剂盒的试剂1和试剂11初步破壁后是质粒释放出来,让后直接电泳观察条带是否滞后,初步验证是否有外源片段成功连接上载体!
6楼2014-08-12 10:36:42
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denverwy123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
万一 原始载体切下来的片段比1.5K大呢
7楼2014-08-12 10:37:05
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gaohuihui at 2014-08-12 10:33:37
质粒载体双酶切前是多大?怎么都没有Marker呢?

5880吧
8楼2014-08-12 10:38:50
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by denverwy123 at 2014-08-12 10:37:05
万一 原始载体切下来的片段比1.5K大呢

现在不是酶切问题,关键是克隆子质粒反而比原质粒跑的快一些
9楼2014-08-12 10:44:25
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xzy0425

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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jiaoxiayoulu(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-15 12:56:40
你细胞破壁厚没有进行其他处理是吧,那你前面的跑得很快的条带就很有可能是宿主菌的DNA。
10楼2014-08-12 12:18:20
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