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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有8人参与

各位虫友，最近构建载体出现一个问题：5.8kb左右的双酶切载体连接1.5kb左右的双酶切pcr产物，涂平板后长了几个菌落，当时心情那个激动啊无法言说！之后做了个菌体电泳，心瞬间冻到了冰点：菌体电泳条带显示几个菌落的电泳条带居然比原始载体（原初质粒没有进行酶切的）的要跑得快！！
其中1,2是原始质粒 3,4,5,6是抗性平板上长出菌落的菌体电泳图，为什么会是这种结果呢？载体构建
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    • 2014-08-12 08:57:10, 2.72 M

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1楼 2014-08-12 08:59:58
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Hliotrope

木虫 (著名写手)
菌体电泳？什么是菌体电泳？上样口真亮啊。。。
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Someone
2楼2014-08-12 10:27:17
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lhxbio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jiaoxiayoulu(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-15 12:56:26
真牛！什么叫菌体电泳？正常程序应该是菌落PCR初步鉴定，然后提质粒酶切，条带大小正确，再送测序。
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3楼2014-08-12 10:31:51
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒载体双酶切前是多大？怎么都没有Marker呢？
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4楼2014-08-12 10:33:37
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gaohuihui

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

还有  你这个菌体电泳是质粒粗提么？
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5楼2014-08-12 10:34:50
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Hliotrope at 2014-08-12 10:27:17
菌体电泳？什么是菌体电泳？上样口真亮啊。。。

将菌液用质粒提取试剂盒的试剂1和试剂11初步破壁后是质粒释放出来，让后直接电泳观察条带是否滞后，初步验证是否有外源片段成功连接上载体！
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6楼2014-08-12 10:36:42
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denverwy123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
万一 原始载体切下来的片段比1.5K大呢
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7楼2014-08-12 10:37:05
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gaohuihui at 2014-08-12 10:33:37
质粒载体双酶切前是多大？怎么都没有Marker呢？

5880吧
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8楼2014-08-12 10:38:50
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by denverwy123 at 2014-08-12 10:37:05
万一 原始载体切下来的片段比1.5K大呢

现在不是酶切问题，关键是克隆子质粒反而比原质粒跑的快一些
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9楼2014-08-12 10:44:25
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xzy0425

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jiaoxiayoulu(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-15 12:56:40
你细胞破壁厚没有进行其他处理是吧，那你前面的跑得很快的条带就很有可能是宿主菌的DNA。
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10楼2014-08-12 12:18:20
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