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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 终止密码子附近序列是否有优化问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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lybio

金虫 (正式写手)

[求助] 终止密码子附近序列是否有优化问题 已有3人参与

大家好！请教个问题。
前期插入载体片段的终止密码子发生突变，未及时查出，进行表达，表达量挺高的（载体本身有终止密码子，C端比目标蛋白多出10来个氨基酸，纯化出的蛋白活性较标准品低了一个数量级）。现将突变了的终止密码子突变正常，而后连接与之前相同的表达载体，发现蛋白不表达了（重复做了多次，都是此结果）。请问各位大侠这是因什么原因造成的？
查了些资料，有说“翻译终止是蛋白生产必须的一步，更有效的翻译终止导致更好的蛋白表达。如果终止密码子附近序列没有最佳化，可能发生明显增加的翻译通读，因此减少了蛋白表达”。如果是因终止密码子附近序列造成，又应该如何优化呢？
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1楼 2014-08-08 09:13:25
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-08 13:45:07
lybio: 金币+5, ★★★很有帮助, 准备弄条下游引物试试 2014-08-11 08:24:17
绝大多数生物都有偏爱的围绕终止密码子的序列框架。酵母和哺乳动物偏爱的终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物最常利用UGA，而昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA。翻译终止效率可能受紧接着终止密码子的下游碱基和紧靠终止密码子的上游序列影响。在酵母中通过改变围绕终止密码子的局部序列框架，翻译终止效率可能被减低几个100倍。对于UGA和UAA，紧接着终止密码子的下游碱基对有效终止的影响力大小次序为G>U，A>C；对于UAG是U、A>C>G。

    对于大肠杆菌，翻译终止效率可因终止密码子及临近的下游碱基的不同而显著不同，从80%（UAAU）到7%（UGAC）。对于UAAN和UAGN系列，终止密码子下游碱基对翻译的有效终止的影响力大小次序为U>G>A、C。UAG极少被大肠杆菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表现了有效的终止，但其后的碱基对有效终止的影响力为G>U，A>C。对于哺乳动物，偏爱的终止密码子为UGA，其后的碱基可以对in vivo翻译终止有8倍的影响（A、G>>C、U）。对于UAAN系列，in vivo终止效率可以有70倍的差别，UGAN系列为8倍。如果终止密码子附近序列没有最佳化，可能发生明显增加的翻译通读，因此减少了蛋白表达。例如，在兔网状细胞无细胞翻译系统里，UGAC的翻译通读可以高达10%，而第四个碱基如果为A，G或C，翻译通读为<1%。
摘自http://www.bioon.com/experiment/nob2/86115.shtml。不知道对您是否有帮助？
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坚持到底就是胜利！
3楼2014-08-08 11:29:06
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songzuowei

木虫 (著名写手)
这个问题是个好问题。坐等高手解答！
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2楼2014-08-08 10:29:11
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dmtxbb

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lybio: 金币+1, ★有帮助, 测过序没问题 2014-08-11 08:24:48
楼上是正解，你再测序看看，是否发生移码突变

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-08-08 11:35:24
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-08 13:47:24
lybio: 金币+1, ★有帮助 2014-08-11 08:25:07
估计是RNA二级结构的问题，通读后的二级结构反而更有利于翻译

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-08-08 13:16:17
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