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电泳结果如此让人泪奔，下一步该如何做呢？已有7人参与
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这是做的浓度梯度，me2+浓度梯度，还有引物浓度梯度，，结果还是如此，下一步怎么让人做下去啊 jh 2014-08-01 15 小时 49 分钟.jpg |
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看体系，没啥大毛病，dNTP稍微有点儿高，4微终浓度1mM，一般终浓度0.2mM 左右。可以试着降低一点儿加1微左右试试，因为dNTP浓度太高PCR也会出不来，mg2+的话 根据TOYOBO的建议终浓度在1.5mM，可以先做下dNTP降低浓度的，然后再试试降低mg，primer 差不多，就这样，还有就是反应条件了，退火温度也可以做梯度，50-60，以前我做乙肝病毒DNA时做过这个范围，再有循环数，30，35，40，或更高，都可以尝试。或者，你可以看看你们实验室其他人有没有已经扩增出来的基因组，借过来用你的反应条件看看能不能扩出来，对比下，如果出来了，就是你基因组问题，如果没出来，看看两者反应体系条件的区别再做调整。祝早日成功！ |
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梦飘雪4楼2014-08-01 20:06:35
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| 我之前做的时候有时候也会出现这种现象，镁离子和dNTP的浓度都稍微降一下，因为dNTP浓度高的话容易出问题。引物10uM浓度，20uL体系一般各需要0.5uL就可以了，多了反而不好。提取出RNA后可以先跑一下电泳，看看是不是有三条条带，也有可能是提取步骤出问题了。退火温度可以改变一下，因为下面有的引物二聚体有点多…… |
12楼2014-08-04 16:56:30
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