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梦飘雪

新虫 (小有名气)

[求助] 电泳结果如此让人泪奔,下一步该如何做呢?已有7人参与

这是做的浓度梯度,me2+浓度梯度,还有引物浓度梯度,,结果还是如此,下一步怎么让人做下去啊

电泳结果如此让人泪奔,下一步该如何做呢?
jh 2014-08-01 15 小时 49 分钟.jpg
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流! 2014-08-01 23:56:41
梦飘雪: 金币+30, 有帮助, 亲,虽效果不好。但还是要谢谢你呢! 2014-08-04 15:31:01
引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦飘雪 at 2014-08-01 17:14:45
谢谢你啊,我扩增的是基因组,片段是366-440bp的片段,用的是rTaq酶。体系是40ul ,
10xbuffer 4ul
Mg2+  4ul ( 25mM)
dNTPs 4ul (10mM)
Taq 0.5ul
template DNA 1.0ul(about 50ng)
primer F 1.60ul
primer R ...

看体系,没啥大毛病,dNTP稍微有点儿高,4微终浓度1mM,一般终浓度0.2mM 左右。可以试着降低一点儿加1微左右试试,因为dNTP浓度太高PCR也会出不来,mg2+的话 根据TOYOBO的建议终浓度在1.5mM,可以先做下dNTP降低浓度的,然后再试试降低mg,primer 差不多,就这样,还有就是反应条件了,退火温度也可以做梯度,50-60,以前我做乙肝病毒DNA时做过这个范围,再有循环数,30,35,40,或更高,都可以尝试。或者,你可以看看你们实验室其他人有没有已经扩增出来的基因组,借过来用你的反应条件看看能不能扩出来,对比下,如果出来了,就是你基因组问题,如果没出来,看看两者反应体系条件的区别再做调整。祝早日成功!

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4楼2014-08-01 20:06:35
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 鼓励回帖交流 2014-08-04 19:35:31
梦飘雪(西门吹雪170代发): 金币+1 2014-08-04 19:35:43
很可能退火温度不合适,先尝试梯度PCR吧
做一个阳光、开朗的小和尚
5楼2014-08-01 21:13:01
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
梦飘雪(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-04 19:36:12
大哥 把你抽的基因组跑电泳的图拿出来晒晒 用基因组为模板扩增目的基因 最重要的是抽提的基因组的质量 最理想的是抽出的基因组跟质粒差不多 一条明亮的主带
11楼2014-08-04 16:02:33
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

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梦飘雪(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-04 19:36:24
梦飘雪: 金币+44, ★★★很有帮助, 谢谢你哦 2014-10-30 09:57:13
我之前做的时候有时候也会出现这种现象,镁离子和dNTP的浓度都稍微降一下,因为dNTP浓度高的话容易出问题。引物10uM浓度,20uL体系一般各需要0.5uL就可以了,多了反而不好。提取出RNA后可以先跑一下电泳,看看是不是有三条条带,也有可能是提取步骤出问题了。退火温度可以改变一下,因为下面有的引物二聚体有点多……
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
12楼2014-08-04 16:56:30
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
说下条件呗,扩增的是基因组,还是质粒,片段多大,用的什么酶,体系,反应条件,要不爱莫能助阿
2楼2014-08-01 16:42:32
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梦飘雪

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-01 16:42:32
说下条件呗,扩增的是基因组,还是质粒,片段多大,用的什么酶,体系,反应条件,要不爱莫能助阿

谢谢你啊,我扩增的是基因组,片段是366-440bp的片段,用的是rTaq酶。体系是40ul ,
10xbuffer 4ul
Mg2+  4ul ( 25mM)
dNTPs 4ul (10mM)
Taq 0.5ul
template DNA 1.0ul(about 50ng)
primer F 1.60ul
primer R 1.60ul
dd H2O 补足至40ul
pcr 反应条件 退火温度是55摄氏度,延伸时间是1min
Justgo!
3楼2014-08-01 17:14:45
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梦飘雪

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-08-01 21:13:01
很可能退火温度不合适,先尝试梯度PCR吧

试过的,上下3度温度梯度,电泳结果仍然是涂带。
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6楼2014-08-02 12:43:43
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梦飘雪

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-01 20:06:35
看体系,没啥大毛病,dNTP稍微有点儿高,4微终浓度1mM,一般终浓度0.2mM 左右。可以试着降低一点儿加1微左右试试,因为dNTP浓度太高PCR也会出不来,mg2+的话 根据TOYOBO的建议终浓度在1.5mM,可以先做下dNTP降低浓 ...

谢谢你啊。我先试试哈
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7楼2014-08-02 12:54:40
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panhp2004

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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梦飘雪: 金币+30, 有帮助, 。效果木有,但还是要谢谢你! 2014-08-04 15:31:48
用基因组为模板时,一般要将基因组稀释20倍左右再扩增,引物稀释10倍就行了,rTaq 酶的话,一般50ul 体系,模板 1ul,引物各2ul ,其它按说明加,退火55,另外可尝试下加 DMSO,减少非特异性。rTaq 酶保真性不高,易突变。

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追梦是一个快乐的过程。
8楼2014-08-03 13:09:36
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梦飘雪

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by panhp2004 at 2014-08-03 13:09:36
用基因组为模板时,一般要将基因组稀释20倍左右再扩增,引物稀释10倍就行了,rTaq 酶的话,一般50ul 体系,模板 1ul,引物各2ul ,其它按说明加,退火55,另外可尝试下加 DMSO,减少非特异性。rTaq 酶保真性不高,易 ...

谢谢你哦!我去试试去,,,,
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9楼2014-08-04 15:25:27
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匿名

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10楼2014-08-04 15:48:13
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