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梦飘雪

新虫 (小有名气)

[求助] 电泳结果如此让人泪奔，下一步该如何做呢？ 已有7人参与

这是做的浓度梯度，me2+浓度梯度，还有引物浓度梯度，，结果还是如此，下一步怎么让人做下去啊

电泳结果如此让人泪奔，下一步该如何做呢？
jh 2014-08-01 15 小时 49 分钟.jpg
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Justgo!
1楼 2014-08-01 15:58:38
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-08-01 23:56:41
梦飘雪: 金币+30, ★有帮助, 亲，虽效果不好。但还是要谢谢你呢！ 2014-08-04 15:31:01
引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦飘雪 at 2014-08-01 17:14:45
谢谢你啊,我扩增的是基因组,片段是366-440bp的片段，用的是rTaq酶。体系是40ul ，
10xbuffer 4ul
Mg2+  4ul ( 25mM)
dNTPs 4ul (10mM)
Taq 0.5ul
template DNA 1.0ul(about 50ng)
primer F 1.60ul
primer R ...

看体系，没啥大毛病，dNTP稍微有点儿高，4微终浓度1mM，一般终浓度0.2mM 左右。可以试着降低一点儿加1微左右试试，因为dNTP浓度太高PCR也会出不来，mg2+的话 根据TOYOBO的建议终浓度在1.5mM，可以先做下dNTP降低浓度的，然后再试试降低mg，primer 差不多，就这样，还有就是反应条件了，退火温度也可以做梯度，50-60，以前我做乙肝病毒DNA时做过这个范围，再有循环数，30，35，40，或更高，都可以尝试。或者，你可以看看你们实验室其他人有没有已经扩增出来的基因组，借过来用你的反应条件看看能不能扩出来，对比下，如果出来了，就是你基因组问题，如果没出来，看看两者反应体系条件的区别再做调整。祝早日成功！
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梦飘雪
4楼2014-08-01 20:06:35
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 鼓励回帖交流 2014-08-04 19:35:31
梦飘雪(西门吹雪170代发): 金币+1 2014-08-04 19:35:43
很可能退火温度不合适，先尝试梯度PCR吧
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做一个阳光、开朗的小和尚
5楼2014-08-01 21:13:01
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
梦飘雪(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-04 19:36:12
大哥 把你抽的基因组跑电泳的图拿出来晒晒 用基因组为模板扩增目的基因 最重要的是抽提的基因组的质量 最理想的是抽出的基因组跟质粒差不多 一条明亮的主带
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11楼2014-08-04 16:02:33
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
梦飘雪(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-04 19:36:24
梦飘雪: 金币+44, ★★★很有帮助, 谢谢你哦 2014-10-30 09:57:13
我之前做的时候有时候也会出现这种现象，镁离子和dNTP的浓度都稍微降一下，因为dNTP浓度高的话容易出问题。引物10uM浓度，20uL体系一般各需要0.5uL就可以了，多了反而不好。提取出RNA后可以先跑一下电泳，看看是不是有三条条带，也有可能是提取步骤出问题了。退火温度可以改变一下，因为下面有的引物二聚体有点多……
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
12楼2014-08-04 16:56:30
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普通回帖

ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说下条件呗，扩增的是基因组，还是质粒，片段多大，用的什么酶，体系，反应条件，要不爱莫能助阿
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2楼2014-08-01 16:42:32
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梦飘雪

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-01 16:42:32
说下条件呗，扩增的是基因组，还是质粒，片段多大，用的什么酶，体系，反应条件，要不爱莫能助阿

谢谢你啊,我扩增的是基因组,片段是366-440bp的片段，用的是rTaq酶。体系是40ul ，
10xbuffer 4ul
Mg2+  4ul ( 25mM)
dNTPs 4ul (10mM)
Taq 0.5ul
template DNA 1.0ul(about 50ng)
primer F 1.60ul
primer R 1.60ul
dd H2O 补足至40ul
pcr 反应条件 退火温度是55摄氏度，延伸时间是1min
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Justgo!
3楼2014-08-01 17:14:45
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梦飘雪

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-08-01 21:13:01
很可能退火温度不合适，先尝试梯度PCR吧

试过的，上下3度温度梯度，电泳结果仍然是涂带。
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Justgo!
6楼2014-08-02 12:43:43
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梦飘雪

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-01 20:06:35
看体系，没啥大毛病，dNTP稍微有点儿高，4微终浓度1mM，一般终浓度0.2mM 左右。可以试着降低一点儿加1微左右试试，因为dNTP浓度太高PCR也会出不来，mg2+的话 根据TOYOBO的建议终浓度在1.5mM，可以先做下dNTP降低浓 ...

谢谢你啊。我先试试哈
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Justgo!
7楼2014-08-02 12:54:40
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panhp2004

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
梦飘雪: 金币+30, ★有帮助, 。效果木有，但还是要谢谢你！ 2014-08-04 15:31:48
用基因组为模板时，一般要将基因组稀释20倍左右再扩增，引物稀释10倍就行了，rTaq 酶的话，一般50ul 体系，模板 1ul，引物各2ul ，其它按说明加，退火55，另外可尝试下加 DMSO，减少非特异性。rTaq 酶保真性不高，易突变。
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梦飘雪
追梦是一个快乐的过程。
8楼2014-08-03 13:09:36
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梦飘雪

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by panhp2004 at 2014-08-03 13:09:36
用基因组为模板时，一般要将基因组稀释20倍左右再扩增，引物稀释10倍就行了，rTaq 酶的话，一般50ul 体系，模板 1ul，引物各2ul ，其它按说明加，退火55，另外可尝试下加 DMSO，减少非特异性。rTaq 酶保真性不高，易 ...

谢谢你哦！我去试试去，，，，
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Justgo!
9楼2014-08-04 15:25:27
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匿名

用户注销 (正式写手)
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10楼2014-08-04 15:48:13
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