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梦飘雪

新虫 (小有名气)

[求助] 电泳结果如此让人泪奔，下一步该如何做呢？ 已有7人参与

这是做的浓度梯度，me2+浓度梯度，还有引物浓度梯度，，结果还是如此，下一步怎么让人做下去啊

电泳结果如此让人泪奔，下一步该如何做呢？
jh 2014-08-01 15 小时 49 分钟.jpg
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Justgo!
1楼 2014-08-01 15:58:38
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panhp2004

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦飘雪: 金币+30, ★有帮助, 。效果木有，但还是要谢谢你！ 2014-08-04 15:31:48
用基因组为模板时，一般要将基因组稀释20倍左右再扩增，引物稀释10倍就行了，rTaq 酶的话，一般50ul 体系，模板 1ul，引物各2ul ，其它按说明加，退火55，另外可尝试下加 DMSO，减少非特异性。rTaq 酶保真性不高，易突变。
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梦飘雪
追梦是一个快乐的过程。
8楼2014-08-03 13:09:36
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说下条件呗，扩增的是基因组，还是质粒，片段多大，用的什么酶，体系，反应条件，要不爱莫能助阿
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2楼2014-08-01 16:42:32
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梦飘雪

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-08-01 16:42:32
说下条件呗，扩增的是基因组，还是质粒，片段多大，用的什么酶，体系，反应条件，要不爱莫能助阿

谢谢你啊,我扩增的是基因组,片段是366-440bp的片段，用的是rTaq酶。体系是40ul ，
10xbuffer 4ul
Mg2+  4ul ( 25mM)
dNTPs 4ul (10mM)
Taq 0.5ul
template DNA 1.0ul(about 50ng)
primer F 1.60ul
primer R 1.60ul
dd H2O 补足至40ul
pcr 反应条件 退火温度是55摄氏度，延伸时间是1min
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Justgo!
3楼2014-08-01 17:14:45
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-08-01 23:56:41
梦飘雪: 金币+30, ★有帮助, 亲，虽效果不好。但还是要谢谢你呢！ 2014-08-04 15:31:01
引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦飘雪 at 2014-08-01 17:14:45
谢谢你啊,我扩增的是基因组,片段是366-440bp的片段，用的是rTaq酶。体系是40ul ，
10xbuffer 4ul
Mg2+  4ul ( 25mM)
dNTPs 4ul (10mM)
Taq 0.5ul
template DNA 1.0ul(about 50ng)
primer F 1.60ul
primer R ...

看体系，没啥大毛病，dNTP稍微有点儿高，4微终浓度1mM，一般终浓度0.2mM 左右。可以试着降低一点儿加1微左右试试，因为dNTP浓度太高PCR也会出不来，mg2+的话 根据TOYOBO的建议终浓度在1.5mM，可以先做下dNTP降低浓度的，然后再试试降低mg，primer 差不多，就这样，还有就是反应条件了，退火温度也可以做梯度，50-60，以前我做乙肝病毒DNA时做过这个范围，再有循环数，30，35，40，或更高，都可以尝试。或者，你可以看看你们实验室其他人有没有已经扩增出来的基因组，借过来用你的反应条件看看能不能扩出来，对比下，如果出来了，就是你基因组问题，如果没出来，看看两者反应体系条件的区别再做调整。祝早日成功！
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梦飘雪
4楼2014-08-01 20:06:35
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