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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western blot 转膜问题!
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A_there

新虫 (初入文坛)

[求助] western blot 转膜问题! 已有6人参与

一共上样上四个孔道，蛋白大小都是14KD左右，SDS-page的胶考染后都能看见条带，但是跑Western blot竟然有的没出来。。。。
我是恒压湿转，100v，电流一开始0.7A，结束时1.5A，转50min，是转膜有问题吗？请各位分析一下~~
谢啦！！
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1楼 2014-05-14 16:58:22
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sunrq516516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你拿丽春红染膜看看……以及我听说考染后是无法转膜的……你的意思应该不是考染后转膜的吧，啊= =？
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Permanent head Damage
2楼2014-05-14 17:57:39
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
逆天的电流，你的胶没有化掉吗？
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3楼2014-05-15 09:52:07
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A_there

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-15 09:52:07
逆天的电流，你的胶没有化掉吗？

我也觉得挺大的，那应该多少呢。。。胶没有化，预染marker转的很清楚。。。。
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4楼2014-05-15 11:39:13
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我170KD的蛋白，300mA转1h。
楼主这电流太恐怖，14KD可能转过了。
话说内参做了吗？
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5楼2014-05-15 15:42:54
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
4楼: Originally posted by A_there at 2014-05-15 11:39:13
我也觉得挺大的，那应该多少呢。。。胶没有化，预染marker转的很清楚。。。。...

我一般不超过200 mA，70 min，70 kDa左右。
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6楼2014-05-15 16:24:25
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李小冬2

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的转膜液配方是什么？7.        TRANSFER BUFFER pH 8.3
a.        Tris Base            3.03g           6.06g            9.09g              12.12g
b.        Glycine               14.4g           28.8g            43.2g              57.6g
c.        Methanol            200mL         400mL         600mL            800mL
d.        MilliQ                                                                           final volume                  
                                      1L                   2L              3L                 4L         
i.        When made accurately, pH should be in the range of 8.1-8.4.  DO NOT ADD ACID OR BASE TO ADJUST pH
ii.        Store at 4C can be reused 2-3x.  Do not discard down sink, must be sent to EH and S chemical waste disposal
参考一下吧，做不出来 可以先做一个内参蛋白。
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7楼2014-05-15 21:29:09
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张力民1598

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

100mA，30分钟足矣。
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8楼2014-05-17 22:32:06
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byh1107

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我的电流一般也不超200mA，并且转膜时间有点短，一般90min,我们隔壁实验室4℃转膜过夜
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9楼2014-05-18 12:50:01
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A_there

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-15 16:24:25
我一般不超过200 mA，70 min，70 kDa左右。...

你们也是恒压吗？多少V？也是在冰里做吗？转完膜之后转膜液温度大概多少？
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10楼2014-05-22 15:45:35
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