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kingsa

木虫 (正式写手)

[求助] Western曝光后无条带,跪求指教!!! 已有12人参与

最近几次Wetern Blot曝光后,发现只有膜的四周有些黑色,中间完全没有条带。
跪求各位大神指教!!!

曝光条带说明:
               前两条分别为12%和15%分离胶分离的目的条带,只有膜的四周有些黑色,中间完全没有条带
               后两条分别为12%和15%分离胶分离的β-actin条带;前者只有膜的四周有些黑色而中间完全没有条带,后者完全曝不出来


实验条件说明:
                 配胶试剂和marker应该没有问题,电泳液、电转液、TBST等试剂都是新配。
                 转膜之后,膜上的marker条带非常清晰,转膜应该没有问题的。
                 目的蛋白分子量为18KD,我剪的膜覆盖了marker  10-25 KD;β-actin分子量为43KD,我剪的膜覆盖了marker  35-55 KD
                 目的蛋白抗体购自Santa Cruz,给的稀释比例建议是100-1000,我用的是1:300(新配);β-actin和二抗按说明书稀释至1:5000
                 曝光时间从30s延长到10min,条带几乎没什么变化



跪求指教啊!!!

Western曝光后无条带,跪求指教!!!
marker.jpg


Western曝光后无条带,跪求指教!!!-1
曝光条带.jpg
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随心而动,如风自在
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kingsa

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by daibingling at 2014-05-09 08:57:27
是不是发光液有问题呢?内参应该很好出来的,而且转膜没问题的话,只能考虑后续的试剂和发光了。

我新订的ECL曝光液,还是现用现配的
随心而动,如风自在
6楼2014-05-09 13:54:45
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查看全部 46 个回答

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

失败乃兵家常事,大侠请重新来过
2楼2014-05-09 08:40:51
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daibingling

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是发光液有问题呢?内参应该很好出来的,而且转膜没问题的话,只能考虑后续的试剂和发光了。
3楼2014-05-09 08:57:27
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sunrq516516

金虫 (小有名气)

★ ★
youlinglyw: 金币+2, 感谢解答 2014-05-09 15:22:14
这个……WB确实是很看RP的事情……
你转膜之后有染一下膜看看没?转的有米有问题?有时候有Marker但不一定蛋白转的OK……
你actin的配比也是1:5000??会不会太稀了……以及虽然可能性比较小……但会不会是一抗不能识别你的sample的species?以前有跑出来过吗?
Permanent head Damage
4楼2014-05-09 09:01:03
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