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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么我用gDNA连一个3kb的片段都扩不出来？
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Carnity

新虫 (正式写手)

[交流] 为什么我用gDNA连一个3kb的片段都扩不出来？

如题，
话说，PCR做过了一大堆，从来还没遇见这种问题，提取的gDNA，定量过（1-2ug/uL），纯度也还不错，用来扩增一个3kb左右的片段，总是扩不出来。退火温度摸过，酶也换过，之前用LA Taq获得过片段，后来扩不出来了。哎，话说都有点怀疑gDNA的 质量问题了。

有没有同遇到这类问题的虫们，来给指点指点啊。
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1楼 2014-04-29 11:19:04
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
★ ★
Carnity: 金币+2 2014-05-05 17:17:09
引物有问题
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2楼2014-04-29 11:20:33
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
★ ★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-04-29 21:17:16
Carnity: 金币+2 2014-05-05 17:17:16
gDNA降解的可能性很大，引物也可能是一个问题
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3楼2014-04-29 18:13:02
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Carnity

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-29 18:13:02
gDNA降解的可能性很大，引物也可能是一个问题

呃，这个gDNA即便降解，应该不会严重到3k都扩不出来吧，有没有好的gDNA提取方法给推荐一下呗，现在用的是SDS-酚氯仿法，不知道会不会影响扩增。
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4楼2014-04-29 18:32:04
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-04 10:00:57
Carnity: 金币+2 2014-05-05 17:17:31
引用回帖:
4楼: Originally posted by Carnity at 2014-04-29 18:32:04
呃，这个gDNA即便降解，应该不会严重到3k都扩不出来吧，有没有好的gDNA提取方法给推荐一下呗，现在用的是SDS-酚氯仿法，不知道会不会影响扩增。...

可以参看《分子克隆实验指南》这本书，按上面的经典方法就可以。另外，在你提好gDNA后最好跑一个电泳看看是否为单一条带
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5楼2014-04-29 19:17:11
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Neo2000

木虫 (著名写手)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-04 10:01:00
Carnity: 金币+1 2014-05-05 17:17:44
可能出在引物设计上，你说具体点，好帮你分析

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6楼2014-04-29 20:27:36
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Carnity

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-29 20:27:36
可能出在引物设计上，你说具体点，好帮你分析

F：CACTGGAGCATCATTACATCACCG
R：CACTACTATGTACCGTGATATGAC
都是20+个碱基，后来摸条件时，退火在48-50℃左右，难不成太短了？
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7楼2014-04-30 11:26:01
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393658000

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+2 2014-05-04 10:01:04
Carnity: 金币+2 2014-05-05 17:17:54
48-50，您这退火温度真心的那个叫低，这样弄以后连下一步优化的机会都直接给灭掉了。另外您这是什么东西的基因组，您也不写一下，没法帮您看其他内容
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8楼2014-05-03 13:38:37
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-04 10:01:08
Carnity: 金币+2 2014-05-05 17:18:04
1. 什么基因组？如何提取的DNA，保存方法是什么？保存了多久？
2. 3k的片段，你的pcr条件是什么？
3. 引物的设计，对于gDNA来说，20左右的碱基已经足够了，只要在基因组其他位置没有错配区就没有问题。
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9楼2014-05-04 06:17:02
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sjmr1221
10楼2014-05-04 07:23:54
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