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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 大家帮忙看下，这个拖带这么严重，但是视乎没有条带，什么情况？是不是加的量太大了？
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-25 06:35:24
能不能出现ladder，还是smear，这取决于你的检测系统的分辨率，更取决于你的DNA单体的大小分布，且不谈还有单链和环状产物的问题。
你要是20-70，比如5bp间隔分布的，别说连接之后，你就是连接之前，用agarose ge ...

是的，之前也是您帮我解答的，听了您的建议。真的真的很感谢您这么真心的帮我，我真的是道行很浅，请原谅。我不是一定要去评估连接的效率，只是想看能不能通过连接反应后的电泳图大致判断下连接片段的长度，后续进行纯化再连接载体转化，由于对于基础知识的欠缺，所以可能说了些蠢话惹你生气了，抱歉哈！
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
11楼2014-04-25 14:12:07
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-25 06:35:24
能不能出现ladder，还是smear，这取决于你的检测系统的分辨率，更取决于你的DNA单体的大小分布，且不谈还有单链和环状产物的问题。
你要是20-70，比如5bp间隔分布的，别说连接之后，你就是连接之前，用agarose ge ...

听了您的建议，我正在查阅相关的欠缺的知识，谢谢您
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
12楼2014-04-25 14:12:47
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by liuyil at 2014-04-25 14:12:07
是的，之前也是您帮我解答的，听了您的建议。真的真的很感谢您这么真心的帮我，我真的是道行很浅，请原谅。我不是一定要去评估连接的效率，只是想看能不能通过连接反应后的电泳图大致判断下连接片段的长度，后续进 ...

呀呀，别搞这么客气，能解决问题就行
一般而言连接产物看不大出来大小的，你若想看大小，直接TA克隆了，用菌落PCR在你得到的克隆里面看，这个也能反映问题。
就是这有一点bias，小片段更容易连接，你要是较真，可以分段回收之后分别克隆。
如果只是大小不一，通过纯化DNA产物，用合适分辨率的胶，还是可以看清楚的
但是现在你这里面肯定有很多环化的产物，片段不太长的时候环化的比线性的跑得快，他在里面一搅合，你就搞不清楚了。
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13楼2014-04-25 14:26:26
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hathryn

新虫 (初入文坛)
我觉得可以纯化一下之后再跑试试
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14楼2014-04-25 16:48:36
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我认为是酶随机链接的问题。不好意思，刚刚短期回国，数天后还要出国。
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15楼2014-04-25 22:19:36
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
非特异性条件太多了....
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
16楼2014-04-26 23:23:46
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不淡定

铜虫 (初入文坛)
降解了吧
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17楼2014-04-27 09:52:09
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 不淡定 at 2014-04-27 02:52:09
降解了吧

这是刚用T4连接酶连接的产物直接进行的，应该不是讲解了，好像应该是这样，我认为biostar2009
说得很有道理。
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
18楼2014-04-27 20:53:35
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 天使托 at 2014-04-26 16:23:46
非特异性条件太多了....

这个不是PCR的，是小片段连接的，用的T4连接酶的，连接产物直接跑得1%的电泳。
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
19楼2014-04-27 20:55:04
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-04-25 15:19:36
我认为是酶随机链接的问题。不好意思，刚刚短期回国，数天后还要出国。

没事，谢谢了
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20楼2014-04-27 20:55:30
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