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yumupeipei铜虫 (小有名气)
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细胞复苏 已有2人参与
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一周前，复苏了一管甜菜夜蛾中肠脂肪体细胞，不知为何，细胞仍未出现贴壁现象。在倒置显微镜下观察时，细胞的外形特征较正常细胞并无异样，培养基中悬浮的细胞浓度很大，较活化时的透光率低，但培养瓶底物无贴壁的细胞出现（将瓶子竖立时，培养瓶底部的细胞也会随着培养液向下滑动 ），请问各位前辈，为何会出现这种情况？如何提高细胞的贴壁率？这批细胞还有必要传代吗？倘若传代的话是否按照悬浮细胞的方法传？谢谢！补充：培养基为sigma的Hink's TNM-FH昆虫培养基，外加10%的牛血清，100单位/ml的青链霉素，培养温度为27度。 |
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3楼2014-03-25 14:30:37
我听五月天
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【答案】应助回帖
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yumupeipei: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-03-25 16:45:16
yumupeipei: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-03-25 16:45:16
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一台转速可到1500的离心机，放在细胞室。复苏后细胞放入10毫升高温灭菌过的离心管，加培养液稀释（降低DMSO浓度），在超静态内封口膜封好离心管口。1000转每分钟离心5分钟，（如果冻存管内细胞数量够多-比如装了一瓶25平方厘米的培养瓶的细胞）离心后底部会看到一小堆白色细胞，如果觉得转速不够可以逐渐增大。弃上清，用新鲜培养液冲出细胞培养。注意一下，应该不会染菌。我们也是大学里的细胞室，跟外面企业的比起来差得远。不知你的细胞离心会不会受影响~  |
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yumupeipei5楼2014-03-25 16:22:07
肖颖2009
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
yumupeipei: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-03-27 08:18:23
silicare: BioEPI+1 2014-03-27 09:34:25
感谢参与，应助指数 +1
yumupeipei: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-03-27 08:18:23
silicare: BioEPI+1 2014-03-27 09:34:25
| 楼上说的都很对啊，我再补充一些。复苏的细胞要在37度水浴锅里解冻。细胞完全解冻后不要在水浴锅里过长时间的放置，那样对细胞不好。解冻后细胞转移至离心管（我们用的是15ml的离心管）再加5ml的预热了的完全培养基，然后离心。离心的转速可以在1000~1500rpm之间。离心完之后的步骤可以按照楼上说的去做~还有一点，细胞冻存之前的状态会直接影响复苏的效果，所以你冻细胞的时候要保证细胞状态很不错再冻比较好。最后 祝你下次复苏细胞成功哦~！ |
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7楼2014-03-26 16:21:38
肖颖2009
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可以把冻存管放在一次性手套中，刚好可以放在一根手指的那个位置，裹好了再拿到外面的水浴锅里。原来我们细胞间也没有水浴锅，还不是拿到外面的水浴锅解冻的。解冻好之后，拿到细胞间前在手套上喷点75%的酒精，再取出冻存管到无菌操作台中，拧开前用沾有75%酒精的棉球对整个冻存管进行擦拭。擦拭完毕后拧开前在酒精灯火焰上稍微过一下盖子处。酒精棉不要太湿，不然在火焰上过的时候容易着火。只要注意规范操作是不会出现污染的。如果觉得冻存管从手套中取出来不方便，可以直接用剪刀剪开更好。祝你实验顺利~！ |
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9楼2014-03-31 17:06:29
肖颖2009
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