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keven7928至尊木虫 (知名作家)
水手
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[求助]
细胞转染效率很低 已有1人参与
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| 自己合成的一个阳离子高分子材料，与DNA在质量比5：1的条件下就有很好结合，但是做细胞实验时，不论5：1, 10:1, 20:1, 30:1 在肿瘤细胞上几乎没有转染，请问什么原因？ |
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【答案】应助回帖
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转染效率收多种因素影响，主要因素有下面几个： 1. 细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。低的 细胞代数（<50）能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂 都会有专门的说明。推荐在转染前24 小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA 摄入的可能。一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。 2. 血清 大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。 通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生 长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右) 试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试 剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下 效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死 亡导致转染效率极低。 3. 载体构建 转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR 产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。 病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定 的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因 污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺 旋及线性DNA 对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行， 因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体 构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。 4. DNA 质量 DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理， 如果DNA 不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成 及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN 公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达 到两倍2x CsCl 梯度离心以上的纯度效果，使您不必为DNA 质量操心。此外，对一些内毒素 敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN 还提供可去除内毒素污染的质 粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。 5.转染技术 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例， 细胞数量，培养及检测时间等。 |
2楼2014-03-14 08:47:27
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