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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求助Millipore0.5ml超滤管的使用
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tangmincui

新虫 (小有名气)

[求助] 求助Millipore0.5ml超滤管的使用已有1人参与

离子交换后，蛋白样品盐含量高，想通过超滤除盐，并换Buffer，下一步要转膜测序。因为样品不到100ul，所以买的0.5ml超滤管。
        但是现在手里只有15ml超滤管的使用方法。现在请教各位高手指点，0.5ml 10kda 超滤管使用方法，特别是离心力上限及其他注意事项。
        越详细越好！谢谢了！
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1楼2014-03-03 15:34:49
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akuau

木虫 (著名写手)
请问你的离子交换是怎么做的？为啥离子交换之后还会有高浓度盐呢？
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学海拾贝
2楼2014-03-06 08:40:01
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tangmincui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by akuau at 2014-03-06 08:40:01
请问你的离子交换是怎么做的？为啥离子交换之后还会有高浓度盐呢？

用Tris-HCl 7.4作为平衡液，上样1ml，再用1.0MNaCl梯度洗脱，电泳检测条带，大约在60%1MNaCl时有蛋白。然后想将收集液脱盐，再做别的实验。
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3楼2014-03-06 12:37:50
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
tangmincui: 金币+5 2014-03-08 09:20:59
和大的一样做就行了，理论上离心力不要超过4000g，但也不会太要紧，加置换buffer的时候可以吹打膜，避免膜堵掉！
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
4楼2014-03-07 08:43:51
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tangmincui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dehong1573 at 2014-03-07 08:43:51
和大的一样做就行了，理论上离心力不要超过4000g，但也不会太要紧，加置换buffer的时候可以吹打膜，避免膜堵掉！

恩，我用的3500g，但是我基本没离心下来什么。之前看4ml超滤管最大可以7500g（35度角度的离心机），所以加大到6500g，还是没有什么东西，我估计是膜堵了。但是样品又很少，100ul，不知道怎么过滤呢?你有什么好办法没？
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5楼2014-03-08 09:24:17
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by tangmincui at 2014-03-08 09:24:17
恩，我用的3500g，但是我基本没离心下来什么。之前看4ml超滤管最大可以7500g（35度角度的离心机），所以加大到6500g，还是没有什么东西，我估计是膜堵了。但是样品又很少，100ul，不知道怎么过滤呢?你有什么好办法 ...

1.你孔径是多少的，小孔径的确实很容易堵，建议增大超滤管孔径，小于目的蛋白一半即可；2. 检测超滤管本身质量是否有问题，用去离子水离离试试；3. 蛋白超滤前用过下0.22um的滤膜；
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6楼2014-03-09 14:36:11
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tangmincui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dehong1573 at 2014-03-09 14:36:11
1.你孔径是多少的，小孔径的确实很容易堵，建议增大超滤管孔径，小于目的蛋白一半即可；2. 检测超滤管本身质量是否有问题，用去离子水离离试试；3. 蛋白超滤前用过下0.22um的滤膜；...

1、是截留分子量吗？我的蛋白40kd多点，所以选择了10kd的。
2、超滤管是Millipore的，我这次买的是0.5ml的，以前买的15ml的，质量应该没有问题。
3、蛋白的确没有过滤， 主要是量太少了，不知道怎么折腾能损失的少一点，一般我都会超滤之前12000r离心20min。然后取上清进行超滤，但是还是离心不下去。
昨天和老师沟通，老师说可能是盐浓度太大，本身已经结晶，所以我准备稀释一下，如果量大了，我就过滤一下，再超滤看看。
谢谢你的热心帮助！
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7楼2014-03-09 21:36:36
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